張華，陳強(qiáng)，劉永靜

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122)

低共熔溶劑(deep eutectic solvents，DES)是近年來發(fā)展的一類新型綠色溶劑，是由一定摩爾比的氫鍵受體和氫鍵供體在一定的溫度下通過氫鍵作用形成的混合物，所制得的DES 具備其熔點(diǎn)比其任何單一組分的熔點(diǎn)更低的特性[1]。DES 與傳統(tǒng)溶劑相比，具有價(jià)格低廉、可生物降解、無毒無害、合成方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[2-4]，目前已經(jīng)成為綠色化學(xué)研究領(lǐng)域中一個(gè)重要的分支，被認(rèn)為是傳統(tǒng)易揮發(fā)有機(jī)溶劑和離子液體的良好替代品，并廣泛應(yīng)用在有機(jī)合成、電化學(xué)、功能材料、分離與萃取領(lǐng)域等各個(gè)領(lǐng)域[5-8]。目前已經(jīng)合成出來的并已經(jīng)應(yīng)用在各個(gè)化學(xué)研究領(lǐng)域的DES，大多數(shù)都是親水性的，在 2015 年之前，疏水性DES 未見任何報(bào)道，這極大地阻礙了DES 在水相中的應(yīng)用，將DES 的應(yīng)用范圍從有機(jī)相擴(kuò)展至水相顯得尤為重要，疏水性低DES 正是在這樣的大背景下出現(xiàn)的。2015 年，巴西里約熱內(nèi)盧聯(lián)邦大學(xué)Bernardo 和葡萄牙新里斯本大學(xué)Catarina 等人首次以 DL-薄荷醇為氫鍵受體，4種天然的有機(jī)酸為氫鍵供體合成了疏水性DES。在隨后的 2016、2017 和 2018 年又有不少關(guān)于疏水性DES 的文章發(fā)表，這些新合成的疏水性DES 在物質(zhì)的萃取與分離過程中獲得了充分的應(yīng)用,如應(yīng)用在萃取并測(cè)定在水中污染物、食品的人工合成色素、農(nóng)藥殘留等方面[9-12]。

非甾體抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)是一類不含有甾體結(jié)構(gòu)的抗炎藥，是全球使用最多的藥物種類之一。大量NSAIDs最終會(huì)進(jìn)入到水環(huán)境當(dāng)中，并成為水環(huán)境中新型的重要污染物之一。因此，對(duì)于環(huán)境水中的NSAIDs的檢測(cè)成為研究熱點(diǎn)[13]。而對(duì)于痕量分析，樣品前處理技術(shù)至關(guān)重要，分散液液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction，DLLME)是2006 年由Assadi 等提出的一種新型少溶劑的樣品前處理技術(shù)，是一種極具應(yīng)用潛力的樣品前處理方法，但是在傳統(tǒng)的DLLME中，常用的萃取劑為三氯甲烷、乙酸乙酯等毒性大、易揮發(fā)的有機(jī)溶劑，存在著操作不便和對(duì)環(huán)境污染較大的缺陷，不能滿足綠色化學(xué)的需求。本研究采用安全、無毒的疏水性DES溶劑為萃取溶劑，應(yīng)用DLLME方法對(duì)水溶液中的酮洛芬、布洛芬、洛索洛芬鈉、萘普生、雙氯芬酸(結(jié)構(gòu)式見圖1)5種非甾體抗炎藥進(jìn)行萃取研究。

1 儀器與試藥

1.1 試驗(yàn)儀器 L2030A高效液相色譜儀(日本島津公司)；KH-3200B 型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；TGL-16G 高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)； AR2140萬分之一分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

1.2 試劑與藥品 甲基三辛基氯化銨(TAC)(含量≥90%，上海源葉生物有限公司)；辛酸、癸酸、月桂酸、硬脂酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；酮洛芬(ketoprofen)對(duì)照品、布洛芬(ibuprofen)對(duì)照品、洛索洛芬鈉(loxoprofen sodium)對(duì)照品、雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium)對(duì)照品、萘普生(naproxen)對(duì)照品均供含量測(cè)定用，由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

2 試驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.05 mol·L-1NaH2PO4(47∶53)；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：264 nm，洛索洛芬鈉為223 nm；柱溫：30 ℃。在該色譜條件下,5種化合物的色譜圖見圖2。

2.2 疏水性DES 的制備 采用加熱攪拌法制備疏水性DES，將TAC分別與4種不同的氫供體按照表1所示的比例混合，置于磁力攪拌器中，在60 ℃的溫度下進(jìn)行攪拌，直至形成均勻澄清透明的溶劑，即得。冷卻后，DES溶劑在室溫下保存。

表1 4種DES溶劑的組成和比例

2.3 對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱取酮洛芬、布洛芬、洛索洛芬鈉、萘普生、雙氯芬酸鈉對(duì)照品11.4、34.5、33.2、28.9和24.6 mg置100 mL量瓶中，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，即得濃度分別為0.114、0.345、0.332、0.289和0.246 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。密封保存，放置于4 ℃的冰箱中備用。使用前需先放置至室溫。

2.4 分散液液微萃取方法 精密量取10 mL添加有5種化合物對(duì)照品的水溶液，加入13.5%(W/V)NaCl，振搖使其溶解。隨后加入乙腈650 μL，DES 300 μL，渦旋60 s，充分振蕩后形成乳白色混濁溶液。將此溶液離心7 min(5 000 rpm，通過試驗(yàn)考察，離心時(shí)間越久，兩相分層越明顯，通過試驗(yàn)考察，當(dāng)離心7 min時(shí)，兩相分層明顯，且吸取上層DES時(shí)操作較容易，因此，選擇離心7 min。)，在離心管上層形成DES液滴聚集相，用微量進(jìn)樣器吸取收集上層DES溶液(約200 μL)，加乙腈至300 μL，0.45 μm 有機(jī)濾膜過濾后，HPLC法分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 DES-DLLME條件篩選

3.1.1 DES種類的篩選 萃取劑的選擇在液相微萃取過程中是至關(guān)重要的。好的萃取劑往往用少量就能夠在大量基質(zhì)中有效地將待測(cè)物萃取出來，同步達(dá)到分離與富集的目的。而DES的組成會(huì)影響DES溶劑的性質(zhì)，進(jìn)而影響對(duì)化合物的萃取率，本研究以長(zhǎng)碳鏈的季銨鹽，甲基三辛基氯化銨為HBA，以4種不同碳鏈長(zhǎng)度的脂肪酸為HBD制備DES溶劑，如表1 所示。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)以硬脂酸為HBD時(shí)，制備DES所需要時(shí)間比較久，且在室溫下放置時(shí)會(huì)析出，因此，選擇D-1～D-3為萃取溶劑，按“2.4”項(xiàng)下萃取條件考察其對(duì)5種NSAID的萃取率。5種NSAID的萃取回收率見圖3A。萃取回收率的公式如下：

其中CD表示在DES層中化合物的濃度，而C0表示化合物在水溶液中的最初濃度。VD和V0表示DES層的體積和水溶液的體積。

從圖3A可見，當(dāng)以DES-2為萃取劑溶時(shí)，5種NSAID的萃取回收率均為最高，因而，選擇DES-2(甲基三辛基氯化銨/癸酸)為最佳萃取溶劑，進(jìn)行下一步試驗(yàn)條件考察。

3.1.2 HBA/HBD比例的考察 制備不同HBA/HBD比例為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 4種DES-2溶劑，并以其作為萃取溶劑，按“2.4”項(xiàng)下方法考察不同HBA/HBD比例對(duì)5種NSAID化合物的萃取率。結(jié)果見圖3B。從圖中可見，5種化合物的萃取率均隨著HBA/HBD比例的增加而增加，并在1∶5時(shí)達(dá)到最大，因此，HBA/HBD的最佳比例選擇為1∶5。

3.1.3 分散劑的選擇 在DLLME萃取過程，分散溶劑的選擇對(duì)于萃取效率至關(guān)重要，分散劑作為一種媒介作用，使得有機(jī)相成為小液滴，更加容易與水相混勻，增加它們之間的接觸面積，有利于萃取效率的提高。本研究中，比較了兩種分散劑，甲醇和乙腈對(duì)5種化合物的萃取率的影響，結(jié)果見圖3C。試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)以甲醇和乙腈作為分散溶劑時(shí)，5種化合物的萃取率并無明顯差異。以乙腈作為分散溶劑時(shí)，提取率略高，因此，選擇乙腈為分散溶劑。

3.1.4 響應(yīng)面分析

3.1.4.1 響應(yīng)面分析因素水平的選取 除上述3個(gè)因素外，萃取劑DES的用量、分散劑的用量以及鹽的濃度對(duì)萃取率也有一定的影響。萃取劑用量多少直接影響分散液液微萃取方法的富集倍數(shù)，萃取劑用量在選擇時(shí)既要滿足一定的萃取率和富集倍數(shù)，還要有足夠的體積以滿足與水相分層。而分散劑用量也是影響萃取率的一個(gè)重要因素。分散劑用量較少時(shí)，萃取劑不能均勻地分散在水中，即不能形成良好的乳濁液體系，導(dǎo)致萃取率降低；而分散劑用量較大時(shí)，會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物在水中的溶解度增大不易被萃取，也會(huì)導(dǎo)致萃取率降低。

為了進(jìn)一步對(duì)DLLME的條件進(jìn)行優(yōu)化，在單因素考察試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，以DES體積，分散劑的體積，NaCl的濃度為考察變量，分別以ABC表示，以5個(gè)化合物的提取率的平均值為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2，RSM分析方案試驗(yàn)結(jié)果、方差分析見表3～4。

表2 響應(yīng)面分析的試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)安排及試驗(yàn)結(jié)果

3.1.4.2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果 從方差分析表中可見，模型F值為69.28，P<0.000 1表明總體上模型因素水平值顯著，因此該試驗(yàn)設(shè)計(jì)是可靠的?；貧w模型中方差結(jié)果還表明，A、B、A2、B2均為顯著項(xiàng)，即DES體積、分散劑體積對(duì)萃取率影響較為明顯，而其他因素不明顯。響應(yīng)面圖見圖3。

表4 方差分析結(jié)果

利用RSM軟件各因素經(jīng)回歸擬合后,解得回歸方程為：

Y=74.9+17.01X1-8.41X2+1.54X3-0.80X1X2+5.61X1X3-5.71X2X3-10.43X12-10.61X22-4.04X32

此外，經(jīng)軟件計(jì)算得到的R2為0.988 9，表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)與每種模型的預(yù)測(cè)提取產(chǎn)率相當(dāng)吻合。根據(jù)RSM的分析，得到提取優(yōu)條件為：A:1.0； B:-0.70；C:0.73，即 DES的體積為300 μL，乙腈的體積為650 μL，氯化鈉的濃度為13.5%，在此條件下，得到的理論最佳平均萃取率為87.45%。在此條件下，得到的理論最佳平均萃取率為87.45%。為檢驗(yàn)RSM法的可靠性,采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行DES-DLLME萃取試驗(yàn),實(shí)際測(cè)得的酮洛芬、布洛芬、洛索洛芬鈉、萘普生、雙氯芬酸鈉的萃取率為89.7%、80.3%、77.1%、92.6%和91.4%，5個(gè)化合物的平均萃取率為86.22%，與理論預(yù)測(cè)值比較接近。

綜上所述，DLLME的最佳條件為以DES(甲基三辛基氯化銨/癸酸=1∶5)為萃取溶劑，以乙腈為分散劑，DES的體積為300 μL，乙腈的體積為650 μL，氯化鈉的濃度為13.5%，在最佳條件下，酮洛芬、布洛芬、洛索洛芬鈉、萘普生、雙氯芬酸鈉的萃取率為89.7%、80.3%、77.1%、92.6%和91.4%。

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別準(zhǔn)確吸取5種對(duì)照品儲(chǔ)備液0.01、0.02、0.05、0.2、0.5、1.0 mL置10 mL量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，配制成一系列不同濃度的混合對(duì)照品溶液，0.45 μm 有機(jī)濾膜過濾，進(jìn)入HPLC，進(jìn)行分析。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，分析物濃度C(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X)，計(jì)算各對(duì)照品回歸方程，結(jié)果見表5。如表所示，各個(gè)對(duì)照品在相對(duì)應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2.2 儀器精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各峰面積的RSD，結(jié)果表明RSD為0.92%，說明儀器精密度良好。

表5 5個(gè)化合物的線性關(guān)系考察結(jié)果

3.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 分別配置10、0.5 μg·mL-1兩種濃度的加標(biāo)樣品，分別置于15 mL尖底離心管，按“分散液液微萃取方法”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)行日內(nèi)精密度和日間精密度考察。日內(nèi)精密度的測(cè)定是在一天之內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行 6 次重復(fù)分析；日間精密度是連續(xù)6 d分析樣品，每天分析 1 次。結(jié)果見表6，日內(nèi)精密度和日間精密度的范圍分別為0.9%～2.9%和 0.9%～3.2%，表明該方法具有較好的重現(xiàn)性。

3.2.4 回收率試驗(yàn) 按照“2.4”項(xiàng)下試驗(yàn)步驟，測(cè)定高、低兩種不同濃度時(shí)分析物的回收率，各個(gè)分析物在高、低兩個(gè)濃度下其平均回收率及RSD(n=3)如表6所示。結(jié)果表明本方法準(zhǔn)確度度較好。

表6 重復(fù)性與回收率試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

本研究建立了疏水性DES-DLLME萃取水溶液中5種非甾體抗炎藥物的方法，該方法的最佳條件為以DES(甲基三辛基氯化銨/癸酸=1∶5)為萃取溶劑，以乙腈為分散劑，DES的體積為300 μL，乙腈的體積為650 μL，氯化鈉的濃度為13.5%，在最佳條件下，酮洛芬、布洛芬、洛索洛芬鈉、萘普生、雙氯芬酸鈉的萃取率為89.7%、80.3%、77.1%、92.6%和91.4%。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，所建立的方法具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，可選擇性的對(duì)水溶液中的5種非甾體抗炎藥物進(jìn)行萃取純化和富集。本方法首次采用合成簡(jiǎn)單、無毒、可生物降解的疏水性DES溶劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)有機(jī)溶劑對(duì)水中的非甾體抗炎藥物進(jìn)行提取，克服了在傳統(tǒng)有機(jī)溶劑由于毒性較大、揮發(fā)性強(qiáng)而帶來的操作不便、對(duì)環(huán)境污染等缺點(diǎn)。