段夢茹，何東升，孫會敏，熊曄蓉*，涂家生*

(1.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，藥用輔料及仿創(chuàng)藥物研發(fā)評價中心，江蘇 南京 210009；2.中國食品藥品檢定研究院，國家藥品監(jiān)督管理局藥用輔料質(zhì)量研究與評價重點實驗室，北京 100050)

泊洛沙姆為環(huán)氧乙烷及環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物，于20世紀(jì)50年代被美國巴斯夫公司以商品名普朗尼克推出后，被廣泛應(yīng)用于藥學(xué)領(lǐng)域。泊洛沙姆中心由聚氧丙烯(POP)分子組成，兩側(cè)是聚氧乙烯(POE)的兩個親水鏈，化學(xué)結(jié)構(gòu)式為H(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aOH[1]。根據(jù)生產(chǎn)過程中環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷相對量的不同，泊洛沙姆分為若干個型號，各個型號間物理性質(zhì)和表面活性千差萬別，泊洛沙姆188共聚物為其中應(yīng)用最為廣泛的一種，其氧乙烯單元(a)為75～85，氧丙烯單元(b)為25～30，氧乙烯(EO)含量79.9%～83.7%，平均分子量為7 680～9 510[2]。泊洛沙姆188作為聚氧乙烯化非離子表面活性劑在藥物制劑領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，可用作藥物制劑的基質(zhì)、增溶劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、吸收促進劑、固體分散體載體等，以實現(xiàn)控制藥物釋放，提高藥物的穩(wěn)定性，增加難溶性藥物的溶解度，提高藥物的生物利用度等目的。其由于特殊的親水性被廣泛用于眼部給藥制劑中[3]，還可應(yīng)用于抗血栓研究[4-5]、血液流變學(xué)研究[6]、藥物長循環(huán)、保持細(xì)胞膜完整性[7-8]、吞噬細(xì)胞活化和中性粒細(xì)胞脫顆粒等方面[9]。

環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷是泊洛沙姆生產(chǎn)工藝中主要原料，其對黏膜和皮膚具有刺激性，可損傷眼角膜，引起呼吸系統(tǒng)灼傷和腫脹，甚至組織壞死，并且具有致突性和致癌性[10]。環(huán)氧乙烷在一定條件下不穩(wěn)定可轉(zhuǎn)化為有害物質(zhì)1,4-二氧六環(huán)。該3種化合物被國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)定義為人體致癌物質(zhì)，其中環(huán)氧乙烷為人體確定致癌物(1類)，環(huán)氧丙烷和1,4-二氧六環(huán)為可能的人體致癌物(2B類)。因此泊洛沙姆中環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷和1,4-二氧六環(huán)的檢測對于保證藥品安全性有效性都具有重要意義。

目前，《中國藥典》《美國藥典》及《歐洲藥典》均規(guī)定了泊洛沙姆中環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷和1,4-二氧六環(huán)的檢查，但《中國藥典》2015年版中所規(guī)定方法在實際應(yīng)用中可行性較低，規(guī)定限度的對照品濃度無法達到定量限，且規(guī)定溶劑二甲基甲酰胺嚴(yán)重干擾環(huán)氧乙烷及環(huán)氧丙烷的檢測，無法對該三種物質(zhì)實現(xiàn)準(zhǔn)確檢測。故本文針對這一問題，優(yōu)化了泊洛沙姆中環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷和1,4-二氧六環(huán)檢查方法，選擇幾乎無干擾且普適易得的超純水作為溶劑，調(diào)整升溫程序使各個色譜峰間分離度達到系統(tǒng)適用性要求，使得三種雜質(zhì)在限度濃度時能夠穩(wěn)定達到定量限，實現(xiàn)環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷和1,4-二氧六環(huán)準(zhǔn)確檢測，為泊洛沙姆的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與試藥

1.1 儀器 Trace 1300、Trace 1310氣相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；DB-624氣相色譜柱(安捷倫公司)；Omni-A 超純水系統(tǒng)(銳思捷公司)；KQ-500E 超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BSA124S型、SECURA24-1CN型電子分析天平(Sartorius公司)。

1.2 試藥 泊洛沙姆188樣品由3個廠家提供(南京威爾藥業(yè)股份有限公司，批號：20161201、20170202、20170901；巴斯夫，批號：GNA19821B、GNA19921B；湖北葛店人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：X171101、X171102、X171103)，按順序編號，記為A1～3，B1～2，C1～3號樣品。環(huán)氧乙烷標(biāo)準(zhǔn)品 (Supelco，批號：48838)；環(huán)氧丙烷標(biāo)準(zhǔn)品(Dr.Ehrenstorfer GmbH ，批號：G152933)；二氧六環(huán)標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號：101136-201101)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品儲備液 環(huán)氧乙烷對照品儲備液：精密移取0.4 mL環(huán)氧乙烷-甲醇溶液(50 mg·mL-1)至已預(yù)先加入約50 mL預(yù)冷超純水的100 mL容量瓶中，輕輕搖動，蓋好瓶塞，將容量瓶放置室溫后用超純水稀釋至刻度，搖勻，作為濃度為200 μg·mL-1的環(huán)氧乙烷標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

環(huán)氧丙烷對照品儲備液：取100 mL容量瓶，加入約50 mL預(yù)冷的超純水，蓋好瓶塞，精密稱重，記錄其重量。用注射器抽取約100 mg(約0.13 mL)的環(huán)氧丙烷，立刻注入容量瓶中，輕輕搖動，蓋好瓶塞，再次精密稱重，前后兩次重量之差即為溶液中所含環(huán)氧丙烷的重量。用超純水稀釋至刻度，搖勻，作為濃度為1 mg·mL-1的環(huán)氧丙烷標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1,4-二氧六環(huán)對照品儲備液：取100 mL容量瓶，用量筒加入約50 mL超純水，蓋好瓶塞，精密稱重，記錄其重量。用注射器抽取約100 mg(約100 μg)的1,4-二氧六環(huán)，立刻注入容量瓶中，輕輕搖動，蓋好瓶塞，再次精密稱重，前后兩次重量之差即為溶液中所含1,4-二氧六環(huán)的重量。用超純水稀釋至刻度，搖勻，作為濃度為1 mg·mL-1的1,4-二氧六環(huán)標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

混合對照品儲備溶液：分別精密移取環(huán)氧乙烷儲備液(200 μg·mL-1)，環(huán)氧丙烷儲備液(1 mg·mL-1)，1,4-二氧六環(huán)儲備液(1 mg·mL-1)各1 mL于同一100 mL容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為環(huán)氧乙烷2 μg·mL-1，環(huán)氧丙烷10 μg·mL-1，1,4-二氧六環(huán)10 μg·mL-1的對照品儲備液。

2.1.2 對照品溶液 對照品溶液：精密移取對照品儲備液0.5 mL，置頂空瓶中，精密加超純水4.5 mL，搖勻，密封，即得。

2.1.3 供試品溶液 供試品溶液：取泊洛沙姆188約l g，精密稱定，置頂空瓶中，精密加超純水5 mL，搖勻，密封，作為供試品溶液。

2.2 色譜條件 色譜條件(1)：參考《中國藥典》2015年版(四部) “泊洛沙姆188”品種下環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷和1,4-二氧六環(huán)檢查項。取本品1 g，精密稱定，置頂空瓶中，精密加二甲基甲酰胺5 mL，搖勻，密封，作為供試品溶液。另取環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷和1,4-二氧六環(huán)適量，用二甲基甲酰胺稀釋制成每1 mL中含0.2、1和1 μg的溶液，精密量取上述溶液5 mL，置頂空瓶中，密封，作為對照溶液。照氣相色譜法(通則0521)測定，用6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷為固定液的毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×1.4 μm)(安捷倫DB-624氣相色譜柱)，柱溫：起始溫度70 ℃，以每分鐘35 ℃的速率升至220 ℃，保持5 min；氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度為280 ℃；進樣口溫度為250 ℃。頂空瓶平衡溫度為80 ℃，平衡時間30 min。采用該色譜條件，環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷及1,4-二氧六環(huán)無法實現(xiàn)有效分離。

色譜條件(2)：以超純水為溶劑，照氣相色譜法(《中國藥典》通則0521)，用6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷為固定液的毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×1.4 μm)(安捷倫DB-624氣相色譜柱)，柱溫：起始溫度35 ℃，保持5 min，以每分鐘5 ℃的速率升至120 ℃，保持5 min，再以每分鐘35 ℃的速率升至220 ℃，保持5 min；氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度為280 ℃；進樣口溫度為250 ℃。頂空瓶平衡溫度為80 ℃，平衡時間30 min，分流進樣。各組分與前后雜質(zhì)分離度均大于 1.5，理論塔板數(shù)大于等于5 000，對該方法進行方法學(xué)考察如下。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 專屬性試驗 精密取超純水5 mL置頂空瓶中，搖勻，密封，作為空白溶劑。

取空白溶劑、供試品溶液、對照品溶液照“2.2”項下色譜條件(2)進樣，記錄色譜圖，空白溶劑對環(huán)氧乙烷，環(huán)氧丙烷，1,4-二氧六環(huán)含量檢測均無干擾。

2.3.2 檢測限與定量限 將對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液溶液逐級稀釋至信噪比為S/N=10時的濃度，即為各雜質(zhì)的定量限；信噪比為S/N=3時的濃度，即為各雜質(zhì)的檢測限。照本文所優(yōu)化試驗條件進行試驗，環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷和1,4-二氧六環(huán)對照品濃度分別為0.080 2、0.400 4和0.399 2 μg·mL-1時照“2.2”項下色譜條件(2)進樣，3種物質(zhì)信噪比均達到3，達到檢測限；環(huán)氧乙烷，環(huán)氧丙烷，1,4-二氧六環(huán)對照品濃度分別為0.160 4、0.800 8、0.798 4 μg·mL-1時照“2.2”項下色譜條件(2)進樣，3種物質(zhì)信噪比均達到10，達到定量限。

2.3.3 線性試驗 分別精密移取對照品儲備溶液0.4、0.45、0.5、0.6、0.7 mL置頂空瓶中，精密加超純水補足體積至5 mL，搖勻，密封，作為1～5線性測試溶液。照“2.2”項下色譜條件(2)進樣，各取樣點重復(fù)測定3次，記錄色譜圖，根據(jù)峰面積進行計算，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)結(jié)果見表1。所擬合線性曲線r≥0.999。各取樣點峰面積RSD應(yīng)不大于8.0%。

表1 環(huán)氧乙烷，環(huán)氧丙烷，1,4-二氧六環(huán)的線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)(n=5)

2.3.4 精密度 取對照品溶液照“2.2”項下色譜條件(2)重復(fù)進樣8次，環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷、1,4-二氧六環(huán)峰面積RSD值分別為4.1%、4.2%、4.7%，均不大于8%，結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 隨機取約1 g一批樣品，經(jīng)外標(biāo)法檢測本底值，共9份分為3組，每組加入一定濃度的對照品溶液進行加樣回收率測定?；厥章试囼灠凑铡吨袊幍洹芬?guī)定限度的80%、100%和120%分別添加低、中、高濃度對照品溶液，即分別向樣品中精密加入0.4、0.5和0.6 mL對照品儲備液，并加入超純水補足體積至5.0 mL。照“2.2”項下色譜條件(2)進行測定，記錄色譜圖，根據(jù)峰面積進行計算。環(huán)氧乙烷80%、100%和120%限度濃度水平下的平均回收率(n=3)分別為87.12%、86.11%和85.31%，其RSD分別為1.5%、3.0%和4.2%；環(huán)氧丙烷80%、100%和120%限度濃度水平下的平均回收率(n=3)分別為82.49%、77.76%和95.94%，其RSD分別為1.2%、2.8%和3.5%；1,4-二氧六環(huán)80%、100%和120%限度濃度水平下的平均回收率(n=3)分別為83.20%、81.01%和108.9%，其RSD分別為3.4%、4.6%和2.0%；各濃度回收率溶液回收率均在75%～120%之間，RSD均不大于8.0%，符合要求。

2.4 樣品含量測定 分別取 9 批不同批次的泊洛沙姆188約1 g，精密稱定，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，以外標(biāo)法計算含量，9批樣品中環(huán)氧乙烷，環(huán)氧丙烷及1,4-二氧六環(huán)均未檢出。

3 討論

3.1 升溫程序的優(yōu)化 環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷沸點較低，照《中國藥典》2015年版(四部)泊洛沙姆188環(huán)氧乙烷，環(huán)氧丙烷，1,4-二氧六環(huán)檢查項方法：“起始溫度70 ℃，以每分鐘35 ℃的速率升至220 ℃，保持5 min”進樣，初始溫度過高，升溫速率過快，環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷和1,4-二氧六環(huán)無法有效分離，無法確定目標(biāo)峰位置(見圖1A)。本文將起始溫度降至35℃，并保持5 min，降低升溫速率至5 ℃·min-1，程序升溫條件優(yōu)化為“起始溫度35 ℃，以每分鐘5 ℃的速率升至120 ℃，保持5 min，每分鐘35 ℃的速率升至220 ℃，保持5 min”(見圖1B)，結(jié)果表明該方法使得環(huán)氧乙烷，環(huán)氧丙烷，1,4-二氧六環(huán)間分離度均不小于2.0，但采用《中國藥典》檢測方法規(guī)定溶劑二甲基甲酰胺，導(dǎo)致環(huán)氧乙烷及環(huán)氧丙烷色譜峰位置有雜峰干擾檢測，故需對溶劑進行優(yōu)化。

3.2 溶劑的選擇 參考《中國藥典》2015年版(四部) “泊洛沙姆188”品種下環(huán)氧乙烷，環(huán)氧丙烷，1,4-二氧六環(huán)檢查項，以二甲基甲酰胺作為溶劑配制對照溶液后，照色譜條件二進樣，氣相色譜圖見圖2A，結(jié)果表明采用二甲基甲酰胺為溶劑時，溶劑在保留時間2～5 min內(nèi)有雜質(zhì)峰，而環(huán)氧乙烷及環(huán)氧丙烷兩目標(biāo)物在此時間段內(nèi)出峰，影響了環(huán)氧乙烷及環(huán)氧丙烷檢測含量檢測；采用頂空級二甲基甲酰胺后雜質(zhì)峰依然影響目標(biāo)物含量檢測(見圖2B)。故更換溶劑為二甲基亞砜及超純水，分別以二甲基亞砜及超純水作為溶劑配制對照溶液后，照色譜條件二進樣，氣相色譜圖見圖2C和圖2D，由圖中可以看出，采用二甲基亞砜為溶劑時，仍然有雜質(zhì)峰存在影響環(huán)氧乙烷及環(huán)氧丙烷的檢測，而采用超純水為溶劑時，由于超純水在氫火焰離子化檢測器上無響應(yīng)，對分析系統(tǒng)無污染，故溶劑在環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷和1,4-二氧六環(huán)出峰位置均無雜質(zhì)峰出現(xiàn)，不影響環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷檢測，且泊洛沙姆188在水中易溶，后續(xù)試驗均采用超純水為溶劑配制對照溶液及供試品溶液。

照優(yōu)化后試驗條件，各樣品以超純水作為溶劑，照色譜條件(2)進樣，對照溶液及供試品溶液氣相色譜圖如圖3所示，環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷及1,4-二氧六環(huán)檢測均不受干擾。

3.3 環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷、1,4-二氧六環(huán)的含量分析 取9批不同批次的泊洛沙姆188，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，9批樣品中環(huán)氧乙烷，環(huán)氧丙烷及1,4-二氧六環(huán)均未檢出。說明不同廠家批次的泊洛沙姆188中環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷及1,4-二氧六環(huán)含量差異不大，基本無此3種有害物質(zhì)殘留。

4 小結(jié)

本文建立了頂空-氣相色譜法同時測定泊洛沙姆中環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷和1,4-二氧六環(huán)殘留量的分析方法，與《中國藥典》2015年版(四部)泊洛沙姆188品種下環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷和1,4-二氧六環(huán)項下檢查方法相比，本文方法優(yōu)化了樣品溶劑及升溫程序，將樣品溶劑由二甲基甲酰胺修改為超純水，消除了溶劑峰干擾，使得檢測方法更簡便易行，溶劑環(huán)保易得，而升溫程序的調(diào)整使得環(huán)氧乙烷及環(huán)氧丙烷以及其他低沸點雜質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)完全分離，色譜峰互不干擾，調(diào)整后方法可行性高、結(jié)果準(zhǔn)確。本方法適用于泊洛沙姆中環(huán)氧乙烷、環(huán)氧丙烷和1,4-二氧六環(huán)殘留量的測定，可為泊洛沙姆188的質(zhì)量控制提供參考。

·綜 述·