田 猛，李純錦，易康樂，周 虛*

（1.吉林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，長春 130062；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，長沙 410131）

奶牛乳腺炎是奶牛場(chǎng)的常發(fā)病之一，癥狀表現(xiàn)為乳房實(shí)質(zhì)、間質(zhì)的炎癥，多由機(jī)械性刺激、病原微生物浸入及化學(xué)物理性損傷所致，結(jié)果導(dǎo)致乳汁中體細(xì)胞數(shù)增加，乳腺組織發(fā)生病理變化。導(dǎo)致奶牛乳腺炎的原因有很多，如病原微生物的感染、遺傳因素、飼養(yǎng)管理因素、環(huán)境因素以及奶牛的年齡和胎次，其中病原微生物感染是主要致病因素，病原微生物主要包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、乳房鏈球菌，感染的微生物因地區(qū)不同而異［1］。臨床型乳房炎往往會(huì)由于不表現(xiàn)臨床癥狀，從而忽略治療的隱性乳房炎發(fā)展而來。

目前，抗生素被列為世界范圍內(nèi)治療乳腺炎的首選。但由于長期使用抗生素，奶牛和牛奶中的抗生素殘留和細(xì)菌耐藥性不僅影響牛奶質(zhì)量，而且對(duì)奶牛和人體健康造成危害［2-3］。尋找可以替代傳統(tǒng)抗生素治療方法的新型、改良的治療方法已成為科研人員的研究重點(diǎn)。近年來中草藥以其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)成為科研工作者研究的熱點(diǎn)。中草藥是一種純天然物質(zhì)，含有多種生物有效成分，具有抗菌消炎的作用，還可以增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫功能。運(yùn)用中草藥治療奶牛乳房炎目前已經(jīng)取得了喜人的成果［4-7］。

本試驗(yàn)通過給健康奶牛、隱性乳房炎組奶牛飼喂發(fā)酵中草藥添加劑，比較使用添加劑前后奶牛體細(xì)胞數(shù)、奶牛血清炎性指標(biāo)、乳脂率和蛋白率的變化，以探究飼喂中草藥添加劑對(duì)奶牛乳腺炎預(yù)防和治療效果。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

胎次、泌乳期、產(chǎn)奶量相近的奶牛40頭，湖南省畜牧獸醫(yī)研究所奶牛場(chǎng)提供。其中隱性乳房炎患病奶牛20頭，判定標(biāo)準(zhǔn)為：乳中體細(xì)胞數(shù)大于5×105個(gè)／mL。

1.2 藥物與試劑

1.2.1 藥物 黃芪、王不留行、魚腥草等中草藥按比例混合均勻，并添加水、芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、丁酸菌、光合細(xì)菌，在適宜環(huán)境發(fā)酵3 d。發(fā)酵菌種來自河南君安生物科技有限公司。

1.2.2 試劑盒 SAA測(cè)試盒（批號(hào)為ml042466）、白細(xì)胞介素1（IL-1β）測(cè)試盒（批號(hào)為ml064295）、白細(xì)胞介素2（IL-2）測(cè)試盒（批號(hào)為ml023901）、白細(xì)胞介素8（IL-8）測(cè)試盒（批號(hào)為ml023909），均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

離心機(jī)（Thermo，美國）、酶標(biāo)儀（BioTek，美國）、移液槍（Eppendorf，德國）、離心管。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

根據(jù)湖南省畜牧獸醫(yī)研究所（DHI）2019年4月份檢測(cè)結(jié)果，選取20頭正常奶牛，分成正常奶牛組和正常奶牛飼喂中草藥奶牛組兩組；選取20頭隱性乳房炎奶牛（奶牛無明顯臨床乳房炎癥狀，正常泌乳，乳汁無肉眼可見異常，但DHI檢測(cè)體細(xì)胞數(shù)大于5×105個(gè)／mL）分為兩組，分別為隱性乳房炎奶牛組和隱性乳房炎飼喂中草藥奶牛組。

2.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)日期為2019年5—6月，每頭奶牛飼喂中草藥量為200 g／（頭·d）的發(fā)酵中草藥添加劑，試驗(yàn)期為30 d。

2.3 奶樣的采集

在使用中草藥復(fù)方添加劑前和飼喂第7，14，21，28天采集試驗(yàn)牛奶樣，放2～5℃保存，并及時(shí)送湖南省畜牧獸醫(yī)研究所（DHI）檢測(cè)乳中體細(xì)胞數(shù)、乳脂率、乳蛋白率。

2.4 血樣的采集與血清的制備

在使用中草藥復(fù)方添加劑第0天和第15天、第30天，在奶牛安靜狀態(tài)下尾根靜脈采血，每頭每次采血3 mL。采血后將血液靜置20～40 min，放入離心機(jī)中3 000 r／min離心5～10 min，分離血清分裝于1.5 mL Eppendof管中，然后放置于-20℃冰箱中保存，待測(cè)。

2.5 檢測(cè)方法

細(xì)胞因子IL-1、IL-2、IL-8以及SAA的測(cè)定。將低溫保存的血清樣室溫解凍，按試劑盒說明書分別進(jìn)行各指標(biāo)含量的測(cè)定。

2.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和One-way ANOVA過程進(jìn)行分析，結(jié)果以“平均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。數(shù)據(jù)差異顯著性標(biāo)注：P≤0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 飼喂中草藥添加劑對(duì)奶牛乳中體細(xì)胞數(shù)的影響

見表1。

表1 奶牛乳中體細(xì)胞數(shù)在飼喂中草藥各時(shí)期的變化 104·m L-1

從表1可見：正常奶牛飼喂中草藥添加劑組與正常奶牛組間比較發(fā)現(xiàn)體細(xì)胞數(shù)沒有明顯的改變變化。從飼喂第14天開始患乳腺炎飼喂中草藥組奶牛體細(xì)胞數(shù)逐漸減少與正常奶牛組體細(xì)胞數(shù)的差距，在第21天與正常奶牛組體細(xì)胞數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。反觀未飼喂中草藥的患乳腺炎組奶牛體細(xì)胞數(shù)保持在較高的水平，且顯著高于正常組奶牛體細(xì)胞數(shù)（P≤0.05）。

3.2 飼喂中草藥對(duì)奶牛乳中乳脂率和乳蛋白率的影響

見表2。

表2 奶牛乳中乳脂率和乳蛋白率在飼喂中草藥各時(shí)期的變化 %

從表2可見：在整個(gè)飼喂試驗(yàn)中，奶牛的乳蛋白率沒有明顯的變化，奶牛的乳脂率變化整體上不明顯，但乳腺炎奶牛飼喂中草藥組隨著飼喂中草藥天數(shù)的增多，乳脂率有了顯著的增長（P≤0.05）。

3.3 飼喂中草藥對(duì)奶牛血清中SAA的影響

見表3。

表3 奶牛血清中SAA含量在飼喂中草藥各時(shí)期的變化 μg·m L-1

從表3可見：乳腺炎奶牛飼喂中草藥組在飼喂第30天，血清中SAA含量跟第0天相比具有顯著差異（P≤0.05），但與正常奶牛組無顯著差異。

3.4 飼喂中草藥對(duì)奶牛血清中IL-1β、IL-2、IL-8水平的影響

見表4。

表4 奶牛血清中IL-2、IL-6、IL-8含量在飼喂中草藥各時(shí)期的變化 ng·L-1

從表4可見：隨著中草藥的飼喂，在正常奶牛組和正常奶牛飼喂中草藥組的奶牛血清中炎癥因子并沒有顯著的變化。在乳腺炎奶牛飼喂中草藥組奶牛血清中IL-1β、IL-2、IL-8三種炎癥因子的水平顯著降低（P≤0.05）。

4 討論

4.1 復(fù)方中草藥添加劑對(duì)奶牛乳腺炎的防治效果

體細(xì)胞數(shù)現(xiàn)在被越來越多的國家作為一種衡量乳腺健康、牛奶質(zhì)量的重要指標(biāo)。牛群的體細(xì)胞數(shù)標(biāo)志著牛場(chǎng)飼養(yǎng)管理水平，可以反映奶牛乳腺的健康狀況［8］。SCC可作為奶牛乳腺炎的檢測(cè)方法，通過定期檢查牛奶中的SCC，比較每次的測(cè)定值，可以查出奶牛群乳房健康狀況以及個(gè)體乳房被感染的程度，從而能及時(shí)診斷隱性乳腺炎，盡早采取措施，減少損失。體細(xì)胞數(shù)是指每毫升奶中白細(xì)胞的數(shù)目，通過檢測(cè)奶牛體細(xì)胞數(shù)可以診斷隱性乳房炎的情況。正常奶牛乳中體細(xì)胞數(shù)小于50萬個(gè)／mL，當(dāng)奶牛發(fā)生乳房炎時(shí)乳中體細(xì)胞數(shù)會(huì)顯著增加［8］。從本試驗(yàn)結(jié)果可以看出，乳腺炎奶牛在飼喂中草藥添加劑后乳中體細(xì)胞數(shù)顯著下降，并下降至接近正常奶牛體細(xì)胞數(shù)水平。蛋白率和乳脂率是衡量牛奶質(zhì)量的重要指標(biāo)，本試驗(yàn)中，飼喂中草藥添加劑后牛奶中乳蛋白率變化不明顯，但在乳腺炎奶牛飼喂中草藥組發(fā)現(xiàn)乳脂率有明顯的上升趨勢(shì)，這與梁濤等［9］的試驗(yàn)結(jié)果相同。因此，長期使用中草藥添加劑能在一定程度上提高奶牛的乳品質(zhì)。同時(shí)正常奶牛飼喂中草藥添加劑組乳中體細(xì)胞數(shù)與未處理的正常奶牛組相比也有一定程度的下降。綜上得出結(jié)論，飼喂復(fù)方中草藥添加劑可以有效治療奶牛乳腺炎，并在一定程度上預(yù)防奶牛體細(xì)胞數(shù)的升高。

4.2 復(fù)方中草藥添加劑對(duì)奶牛血清中炎性標(biāo)記物以及炎癥因子水平的影響

奶牛乳腺炎的臨床癥狀主要是炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為以血管通透性增加和白細(xì)胞遷移為特征的非特異性炎癥。已有研究證明，奶牛發(fā)生乳腺炎時(shí)乳中體細(xì)胞數(shù)目會(huì)大幅度上升，特別是白細(xì)胞數(shù)目顯著增加［10］。白細(xì)胞實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用主要依賴于自身具有的游走性、趨化性和吞噬作用等。奶牛乳腺炎是一個(gè)全身性的病理過程，不僅乳腺組織遭到破壞，血液成分也發(fā)生了變化，同時(shí)預(yù)示乳腺炎奶牛有炎癥的發(fā)生［11］。

SAA是由肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞合成的載脂蛋白家族，是一種較新的急性期反應(yīng)物。目前是臨床檢測(cè)常用的炎性指標(biāo)，當(dāng)發(fā)生細(xì)菌和病毒感染時(shí)機(jī)體內(nèi)的SAA水平明顯升高［12］。檢測(cè)原理是因?yàn)镾AA由局部參與炎癥的細(xì)胞產(chǎn)生并伴有系統(tǒng)性溢出現(xiàn)象，所以可作為局部和全身炎癥的標(biāo)志物［13］。此外SAA還具有多種生物學(xué)功能，包括內(nèi)毒素的解毒、抑制免疫反應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞黏附以及遷移等多種生理、病理過程。機(jī)體內(nèi)的SAA主要來源于肝細(xì)胞中的C-SAA，在機(jī)體受到刺激后會(huì)受到產(chǎn)生的一系列細(xì)胞因子的作用，此時(shí)A-SAA成為體內(nèi)主要的SAA。雖然在醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域SAA作為炎性指標(biāo)已經(jīng)很成熟，但用其作為炎性指標(biāo)在動(dòng)物體內(nèi)的研究還較少。薛永康等［14］證實(shí)，乳清中的SAA水平可以作為奶牛隱性乳腺炎的診斷指標(biāo)。張思學(xué)等［15］報(bào)道，奶牛乳腺炎的發(fā)病程度與乳中SAA水平成正相關(guān)。王洪偉［16］認(rèn)為，患不同程度乳腺炎的牛乳中SAA水平是判定奶牛乳腺損傷的重要依據(jù)。楊永新等［17］證實(shí)，奶牛乳房炎導(dǎo)致血清中SAA水平增加明顯。本試驗(yàn)中，奶牛血清中SAA水平隨中草藥治療時(shí)間延長明顯下降，表明中草藥添加劑對(duì)奶牛乳房炎具有明顯的治療作用。

炎癥細(xì)胞因子是指參與炎癥反應(yīng)的各種細(xì)胞因子。白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）是一種主要由活化T細(xì)胞產(chǎn)生的具有多向性作用的細(xì)胞因子。白細(xì)胞介素8（interleukin-8，IL-8）是一種主要來源于單核-巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板等的中性粒細(xì)胞趨化和活化因子。白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）是由單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和其他類型細(xì)胞在應(yīng)答感染時(shí)產(chǎn)生的細(xì)胞因子。孫厚啟［18］證實(shí)了在炎性乳腺組織中IL-2的表達(dá)顯著上升。劉本君等［19］證實(shí)了血液中IL-8可作為奶牛乳腺炎的診斷指標(biāo)。尹柏雙等［20］的研究證實(shí)乳清中IL-1β含量與奶牛隱性乳房炎發(fā)病程度呈正相關(guān)。在本試驗(yàn)中，飼喂中草藥添加劑治療患乳腺炎奶牛過程中，奶牛血清中IL-1β、IL-2、IL-8含量隨治療時(shí)間延長明顯下降，與血清炎性指標(biāo)結(jié)果相同，進(jìn)一步證實(shí)血液中IL-1β、IL-2、IL-8也可作為奶牛乳腺炎的診斷指標(biāo)。

5 結(jié)論

由黃芪、王不留行、魚腥草等中藥按照一定的比例配制而成后發(fā)酵的復(fù)方中草藥能夠降低隱性乳腺炎患病奶牛乳中的體細(xì)胞數(shù)和血液中SAA、IL-1β、IL-2、IL-8水平，對(duì)奶牛的隱性乳房炎具有較好的治療作用和一定的抗炎作用。說明中草藥對(duì)奶牛乳腺炎具有一定的預(yù)防功能，而且安全、無副作用。