任敬宇，徐 華，朱 捷，3*

（1.內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021；2.河北省廊坊市農(nóng)業(yè)局，河北 廊坊 065000；3.河北省廊坊市六驥公司，河北 廊坊 065000）

1996年7月5 日世界上第一只體細(xì)胞克隆綿羊-多莉（Dolly）在英國(guó)蘇格蘭愛(ài)丁堡郊外的羅斯林研究所誕生。她的降生不僅開(kāi)創(chuàng)了動(dòng)物繁殖生物學(xué)的新篇，而且也為動(dòng)物胚胎干細(xì)胞的理論及其利用和后來(lái)誘導(dǎo)干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）方法的建立提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)踐。同時(shí)，動(dòng)物的體細(xì)胞克隆技術(shù)及其衍生的胚胎干細(xì)胞和干細(xì)胞定向分化技術(shù)為一個(gè)嶄新的領(lǐng)域——細(xì)胞治療與修復(fù)醫(yī)學(xué)（regenerative medicine）奠定了理論基礎(chǔ)和可能。為千千萬(wàn)萬(wàn)位患者，特別是很多細(xì)胞退型性疾?。ㄈ缒X癱、帕金森病等）的患者帶來(lái)福音。目前，動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)表明，應(yīng)用克隆技術(shù)不僅可以有效治療這些疑難病癥，而且能夠使患病動(dòng)物完全康復(fù)。然而，和其他重大科學(xué)發(fā)現(xiàn)一樣，體細(xì)胞核移植技術(shù)的發(fā)展也是經(jīng)歷了一代一代科學(xué)家一個(gè)多世紀(jì)的艱難探索才取得了今天的成績(jī)。在這艱難探索的道路上，涌現(xiàn)出許多優(yōu)秀的科學(xué)家，其中包括兩名諾貝爾獎(jiǎng)獲得者和他們感人的故事。以下將介紹一些在一個(gè)多世紀(jì)中為尋找科學(xué)真理而做出重要貢獻(xiàn)的科學(xué)家們以及他們背后的故事。

1 故事的起源

德國(guó)生物學(xué)家AugustWeissman（全名是August Friedrich Leopold Weismann）1834年1月17日出生于德國(guó)法蘭克福（Frankfurt），1914年11月5日死于德國(guó)福萊博格（Freiburg）。他一生致力于生物學(xué)的研究，是遺傳學(xué)和DNA學(xué)說(shuō)建立的先驅(qū)者之一。他反對(duì)后天性狀遺傳學(xué)說(shuō)，并創(chuàng)立了“種質(zhì)”理論（“germ plasm”theory）。早在1885年他就提出了一個(gè)假說(shuō)，即胚胎細(xì)胞的部分種質(zhì)（germ plasm，相當(dāng)于基因組）將會(huì)隨著胚胎細(xì)胞在發(fā)育的過(guò)程逐漸失去，而決定細(xì)胞最終發(fā)育的那些種質(zhì)將被保留下來(lái)［1］。這個(gè)假說(shuō)意味著一個(gè)分化了的細(xì)胞核將無(wú)法重新控制整個(gè)后代的發(fā)育，因?yàn)樗呀?jīng)不再具有所有細(xì)胞發(fā)育所需要的種質(zhì)結(jié)構(gòu)。也就是說(shuō)，胚胎細(xì)胞分化的過(guò)程是不可逆的！從那時(shí)起，一代代科學(xué)家們圍繞這個(gè)假說(shuō)進(jìn)行了大量的科學(xué)試驗(yàn)，并取得了顯著的進(jìn)展。然而一個(gè)世紀(jì)過(guò)去了，科學(xué)家們始終無(wú)法得到完美的答案。直到“多莉”出生，這一跨世紀(jì)的假說(shuō)才有了最完美的答案。

2 早期的探索

無(wú)性繁殖的英文名稱(chēng)叫“clone”，譯音為“克隆”。實(shí)際上，英文“clone”起源于希臘文“klone”，原意是用“嫩枝”或“插條”繁殖。時(shí)至今日，“克隆”的含義已不僅僅是“無(wú)性繁殖”，凡來(lái)自一個(gè)祖先、經(jīng)過(guò)無(wú)性繁殖出的一群個(gè)體，也叫“克隆”。對(duì)動(dòng)物克隆而言，克隆的方法有早期胚胎卵裂球的分離、胚胎的切割、細(xì)胞核移植等。由于受到諸多條件（如培養(yǎng)液和培養(yǎng)環(huán)境）的限制，早期的試驗(yàn)主要停留在低等動(dòng)物上，如海星、爬行動(dòng)物與兩棲動(dòng)物。19世紀(jì)末20世紀(jì)初，一位德國(guó)實(shí)驗(yàn)科學(xué)家Wilhelm Roux（1850—1924）［2-3］于1885年損毀2-細(xì)胞青蛙胚胎中的一個(gè)卵裂球，發(fā)現(xiàn)未被損毀的卵裂球仍然可以發(fā)育成一個(gè)正常個(gè)體。此后，另一位德國(guó)的哲學(xué)家和發(fā)育生物學(xué)Hans Driesch（1867—1941，全名Hans Adolf Eduard Driesch），于1891年將2-細(xì)胞的海星卵分離成兩個(gè)單個(gè)卵裂球，而這兩個(gè)單個(gè)的卵裂球分別發(fā)育成兩個(gè)單獨(dú)的正常海星幼體。此后，他又采用4-細(xì)胞海星卵做了同樣的試驗(yàn)，并取得了相似的結(jié)果。結(jié)果表明，至少在分裂成4-細(xì)胞的海星胚胎中每一個(gè)卵裂球仍然具有與1-細(xì)胞受精卵相同的發(fā)育潛力［4］?？赡苁请S著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加，試驗(yàn)的難度也大大增加，遺憾的是他并沒(méi)有將試驗(yàn)繼續(xù)下去。

另一位德國(guó)胚胎學(xué)家和解剖學(xué)家August Antonius Rauber（1841—1917）［5］可能是世界上第一位提出核移植的概念并且親自實(shí)踐的科學(xué)家。1886年他采用兩支注射器在受精后1小時(shí)時(shí)，將1只青蛙和蟾蜍受精卵的細(xì)胞核進(jìn)行了交換。不出意外，這次試驗(yàn)以失敗告終。2個(gè)互換核的細(xì)胞都停止發(fā)育，并沒(méi)有分裂。不過(guò)，Antonius Rauber推測(cè)這樣的核移植細(xì)胞應(yīng)該具有可遺傳性。幾乎就在同一時(shí)期，美籍德國(guó)生物學(xué)家Jacques Loeb（1859—1924）在采用不同的鹽濃度進(jìn)行海星卵子孤雌激活的試驗(yàn)時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)，一些早期胚胎產(chǎn)生了很大的水泡［3］。而這個(gè)水泡有著特殊的性質(zhì)，即當(dāng)胚胎其他部分仍在發(fā)育時(shí)水泡并沒(méi)有發(fā)生任何的變化。后來(lái)他觀察到，當(dāng)將1個(gè)細(xì)胞核移入水泡中時(shí)，這個(gè)水泡也開(kāi)始發(fā)育。如果把這個(gè)水泡與它所在的胚胎分離，分離的水泡仍然具有獨(dú)立發(fā)育的潛能。這一發(fā)現(xiàn)表明，通過(guò)細(xì)胞核之間的移動(dòng)可以創(chuàng)造新的胚胎。他的發(fā)現(xiàn)為現(xiàn)代核移植技術(shù)的發(fā)展以及后來(lái)利用物種之間的核移植研究進(jìn)化過(guò)程奠定了基礎(chǔ)。他認(rèn)為任何低等動(dòng)物的所謂本能只不過(guò)是物理化學(xué)反應(yīng)，他稱(chēng)之為趨向性。在Jacques Loeb試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，法國(guó)動(dòng)物學(xué)家Yves Delage（1854—1920）又將試驗(yàn)向前推進(jìn)了一步。他采用化學(xué)方法激活海星卵子，并且發(fā)展了培養(yǎng)孤雌激活海星卵子的方法。然而他的貢獻(xiàn)主要集中在理論上。他認(rèn)為，細(xì)胞分化是來(lái)自同一細(xì)胞所產(chǎn)生兩個(gè)子細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)成分不同導(dǎo)致的。他還推測(cè)“每一個(gè)核，至少在發(fā)育成個(gè)體之前相當(dāng)于一個(gè)受精卵的細(xì)胞核。假如沒(méi)有任何退化的話(huà)，這個(gè)卵的核應(yīng)該可以被任何一個(gè)正常胚胎的細(xì)胞核所替換，我們大概應(yīng)該可以看到這個(gè)卵可以正常的發(fā)育，不會(huì)有任何的變化”。這樣的表述已經(jīng)非常接近現(xiàn)在核移植的概念（將一個(gè)細(xì)胞核植入一個(gè)去核的卵子中）。但遺憾的是他并沒(méi)有給出具體實(shí)施核移植的方法［6-7］。而他的這個(gè)預(yù)言以及核移植的概念直到大約60年后才被Briggs和King所驗(yàn)證［8-9］。

和以前的海星試驗(yàn)不同，德國(guó)胚胎發(fā)育學(xué)家Hans Spemann（1869—1941）采用一種爬行動(dòng)物——蠑螈（salamander）作為試驗(yàn)材料，成功重復(fù)了前人在海星試驗(yàn)中所觀察到的結(jié)果。因此，他也被公認(rèn)為“克隆之父”［10］。不僅如此，他還建立了胚胎顯微操作方法，并進(jìn)行了大量試驗(yàn)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)了胚胎發(fā)育過(guò)程的“組織效應(yīng)”（Organizer-Effect），也被稱(chēng)為Spemann理論。由于這些開(kāi)創(chuàng)性的研究成果，1935年Hans Spemann被授于諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。Spemann的核移植試驗(yàn)示意圖見(jiàn)圖1。

Hans Spemann的很多經(jīng)典試驗(yàn)至今仍然被人們津津樂(lè)道。例如，他用出生不久女兒的頭發(fā)所做的核移植實(shí)驗(yàn)，即“延遲成核實(shí)驗(yàn)”（delayed nucleation experiment）被稱(chēng)之為“夢(mèng)幻實(shí)驗(yàn)”（fantastical experiment）。他用女兒的頭發(fā)控制一個(gè)正在發(fā)育的蠑螈1-細(xì)胞受精卵的細(xì)胞核，然后將頭發(fā)系緊此受精卵，使之分為一邊含有1個(gè)核，另一邊只有細(xì)胞質(zhì)，而沒(méi)有細(xì)胞核。當(dāng)含有核的部分分裂4次后，即16-細(xì)胞時(shí)期，小心地放松頭發(fā)，使一個(gè)核釋放進(jìn)入只有細(xì)胞質(zhì)的部分。然后再次系緊這個(gè)胚胎，并使之一分為二，其中一部分含有15個(gè)核，而另一部分僅含有1個(gè)核。最后，被頭發(fā)分開(kāi)的這兩部分胚胎分別發(fā)育成兩個(gè)正常的蠑螈。他的試驗(yàn)再一次證明，一個(gè)分裂4次的蠑螈胚胎細(xì)胞核仍然具有全能性（totipotency），也就是說(shuō)，至少來(lái)自16-細(xì)胞蠑螈胚胎的細(xì)胞核并沒(méi)有失去發(fā)育能力。顯然，這樣的結(jié)果并沒(méi)有支持AugustWeissman的假說(shuō)。但是這些結(jié)果僅僅證明對(duì)海星及蛙類(lèi)早期胚胎而言，16-細(xì)胞胚胎中的每個(gè)卵裂球仍然具有全能性，但是并不知道這些動(dòng)物16-細(xì)胞后的核是否仍然具有同樣的能力。因此，1938年Hans-Spemann又明確地提出，當(dāng)體細(xì)胞核被植入一個(gè)胚胎細(xì)胞中是否能夠發(fā)育成一個(gè)新的生物體的問(wèn)題［3］。Hans Spemann的問(wèn)題是August Weissman假說(shuō)的發(fā)展，也更具挑戰(zhàn)性。

3 兩棲動(dòng)物細(xì)胞的核移植

在20世紀(jì)初，動(dòng)物胚胎學(xué)包括核移植研究經(jīng)歷一個(gè)快速的發(fā)展時(shí)期之后，核移植的研究又處于一個(gè)相當(dāng)長(zhǎng)的停滯期。直到1952年，美國(guó)發(fā)育生物學(xué)家RobertWilliam Briggs（1911—1983）和他的助手Thomas Joseph King Jr.（1921—2000）在《美國(guó)科學(xué)院院報(bào)》發(fā)表了題為《青蛙囊胚核移植去核卵子的研究》論文［8］，引起了科學(xué)界的震動(dòng)。他們不僅僅將囊胚期的細(xì)胞核移植入去核的卵子中，而且成功獲得了可正常發(fā)育的蝌蚪。他們的成果被稱(chēng)之為人類(lèi)歷史上第一次真正動(dòng)物核移植的成功。RobertWilliam Briggs和Thomas Joseph King Jr.，前者動(dòng)腦，富有遠(yuǎn)見(jiàn)，而后者動(dòng)手，心靈手巧，兩人的合作真可謂是“珠聯(lián)璧合”。他們之所以取得成功，其中一個(gè)很重要的原因是就在于他們選對(duì)了適合的試驗(yàn)動(dòng)物——北美豹蛙（North American leopard frog Rana pippiens）。北美豹蛙體外排卵，卵細(xì)胞體積大，非常便于實(shí)驗(yàn)操作。而且受精卵中的每個(gè)細(xì)胞核很易分離，更重要的是北美豹蛙受精卵在水中能成長(zhǎng)發(fā)育，對(duì)培養(yǎng)條件要求很低。和很多天才科學(xué)家相比RobertWilliam Briggs有著艱難曲折的人生經(jīng)歷。在他兩歲時(shí)母親和兄弟因患結(jié)核而雙雙去世，他是由爺爺與奶奶帶大。在上中學(xué)時(shí)他跟隨姑姑學(xué)習(xí)鋼琴，并對(duì)音樂(lè)產(chǎn)生了濃厚的興趣?？墒窃诮?jīng)濟(jì)大蕭條時(shí)期，即便是在中學(xué)期間，因生活所迫，他也不得不利用暑假去鞋廠做工，冬季則做為一名五弦琴手參加樂(lè)隊(duì)在新罕布什爾州南部（Southern New Hampshire）巡回演出。在中學(xué)時(shí)他受到了生物學(xué)老師的啟發(fā)，對(duì)生物學(xué)產(chǎn)生了濃厚的興趣。然而由于生活所迫，1929年中學(xué)畢業(yè)以后，他選擇進(jìn)入波士頓大學(xué)的商業(yè)行政學(xué)院學(xué)習(xí)，而并沒(méi)有選擇自己喜愛(ài)的生物學(xué)。然而入校不久，他發(fā)現(xiàn)自己對(duì)商學(xué)課程沒(méi)有興趣，轉(zhuǎn)而去文科學(xué)院學(xué)習(xí)有關(guān)科學(xué)的課程。在經(jīng)過(guò)仔細(xì)考慮之后，Briggs選修了許多教育學(xué)院有關(guān)教授科學(xué)的課程，希望畢業(yè)后能夠成為一名教授科學(xué)的老師。1934年Briggs從波士頓大學(xué)獲得了科學(xué)學(xué)士學(xué)位，后進(jìn)入哈佛研究生院開(kāi)始了蛙類(lèi)發(fā)育生物學(xué)的研究。1938年他被哈佛大學(xué)授于了博士學(xué)位。1938—1942年他在加拿大McGill大學(xué)動(dòng)物系從事蛙類(lèi)癌癥的研究。1942年他進(jìn)入美國(guó)Lankenau醫(yī)院研究所（后來(lái)更名為癌癥研究所和Fox Chase癌癥中心）從事與蛙類(lèi)癌癥相關(guān)的基礎(chǔ)研究。1952年Briggs和Thomas J.King合作，成功地將未分化的囊胚細(xì)胞核植入一個(gè)去核的卵子中，并得到了可發(fā)育的正常后代［8］。他們所改進(jìn)的核移植方法也為后來(lái)體細(xì)胞核移植的研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。他們也因此獲得了很多的獎(jiǎng)項(xiàng)，其中最重要的是1973年法國(guó)科學(xué)院頒發(fā)的Charles-Leopold Mayer獎(jiǎng)，這是法國(guó)科學(xué)界的最高獎(jiǎng)，也是法國(guó)第一次頒發(fā)給法國(guó)以外的科學(xué)家。然而，1977年Briggs和King做了一系列的核移植試驗(yàn)表明，當(dāng)采用囊胚細(xì)胞核作為供體核時(shí)，核移植后產(chǎn)生正常蝌蚪的效率是35%；如果采用晚期原腸胚內(nèi)胚層（late gastrula endoderm）的細(xì)胞，其效率僅為6%；而采用神經(jīng)后期或以后期（post-neurula or later stages）細(xì)胞核移植的細(xì)胞將停止發(fā)育。這些結(jié)果表明，供體細(xì)胞的分化程度和核移植之后的效率呈負(fù)相關(guān)。因此，他們得出結(jié)論：分化了的蛙胚胎細(xì)胞無(wú)法正?；氐脚咛サ脑紶顟B(tài)，即全能態(tài)（totipotency）［9，11］。

不久，這個(gè)結(jié)論很快就被另外一位英國(guó)生物學(xué)家John Bertrand Gurdon所改寫(xiě)。1958年John Gurdon和他的導(dǎo)師Michael Fischberg博士在自然雜志上發(fā)表了他博士論文，題為“體細(xì)胞核移植可以產(chǎn)生性成熟的非洲有爪蟾蜍”［12］。他們首次證明，非洲有爪蟾蜍的體細(xì)胞具有與受精卵一樣的基因。通過(guò)核移植分化了的非洲有爪蟾蜍的細(xì)胞核仍然可以回到胚胎發(fā)育的起點(diǎn)。經(jīng)歷了半個(gè)多世紀(jì)，2012年John B.Gurdon終于迎來(lái)了屬于他的高光時(shí)刻，他被授予當(dāng)年的諾貝爾生理和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。和Briggs教授不同的是，John Gurdon1933年出生于一個(gè)貴族家庭，從小就受到了良好的教育。但他并未像很多天才科學(xué)家那樣很小就顯露出聰穎的天資。相反，他被認(rèn)為是一位頭腦不正常的孩子。在他剛上當(dāng)?shù)氐囊凰搅⑿W(xué)時(shí)，一次智力測(cè)驗(yàn)老師讓學(xué)生們畫(huà)一個(gè)橘子，John Gurdon由于吃、住、行從小一切由母親安排，從未見(jiàn)過(guò)橘子。他只好畫(huà)了一支樹(shù)枝，暗示橘子是生長(zhǎng)在樹(shù)上的。當(dāng)老師看到卷子后，氣憤地將他的卷子撕了，并告訴他的父母，他們的兒子智力有問(wèn)題，需要接受特殊教育。無(wú)奈，他的父母只好把他轉(zhuǎn)到另外一所私立小學(xué)學(xué)習(xí)。John Gurdon的中學(xué)時(shí)代是在英國(guó)最著名的伊頓公學(xué)院，也是英國(guó)最有名的貴族中學(xué)度過(guò)的。在中學(xué)時(shí)期，盡管他對(duì)動(dòng)物和昆蟲(chóng)表現(xiàn)出極大的興趣，但是他的生物學(xué)在250名同齡學(xué)生中成績(jī)墊底，以致于老師不得不取消了他繼續(xù)學(xué)習(xí)生物學(xué)的資格，而讓他由理科改學(xué)文科的拉丁語(yǔ)、古希臘語(yǔ)以及現(xiàn)代語(yǔ)言等語(yǔ)言類(lèi)課程。他的生物學(xué)老師甚至在評(píng)語(yǔ)中寫(xiě)到，他想成為一名科學(xué)家的夢(mèng)想簡(jiǎn)直就是“異想天開(kāi)”。當(dāng)他中學(xué)畢業(yè)報(bào)考牛津大學(xué)時(shí)，由于他缺少生物學(xué)的成績(jī)而被拒絕參加理科的入學(xué)考試，只能去報(bào)考文科專(zhuān)業(yè)。但他又不愿意放棄動(dòng)物學(xué)。無(wú)奈，通過(guò)在牛津大學(xué)工作的親戚的“后門(mén)”，John Gurdon終于可以有條件地參加理科的入學(xué)考試。條件是他必須在一年內(nèi)補(bǔ)習(xí)他所欠缺的《生物學(xué)》并達(dá)到要求，他的父母還專(zhuān)門(mén)為他請(qǐng)了私人教師給他補(bǔ)習(xí)。功夫不負(fù)有心人，后來(lái)他終于被動(dòng)物系有條件錄取。他必須在第一年的預(yù)科期內(nèi)通過(guò)物理、化學(xué)和生物等基礎(chǔ)學(xué)科考試后才能開(kāi)始正式學(xué)習(xí)。這種事在現(xiàn)在的牛津大學(xué)再也不可能發(fā)生。幸運(yùn)的是John Gurdon最終達(dá)到了這些要求并開(kāi)始了牛津大學(xué)動(dòng)物系的學(xué)習(xí)。在大學(xué)期間，John Gurdon對(duì)昆蟲(chóng)非常感興趣，并希望將來(lái)攻讀昆蟲(chóng)方向的博士。因此，他報(bào)名參加了系里組織的項(xiàng)目，去大學(xué)的自然保護(hù)區(qū)調(diào)查昆蟲(chóng)物種的種類(lèi)與數(shù)量。在野外采樣期間，John Gurdon捕捉到一種他無(wú)法確定的蠅。于是他將蠅送到位于英國(guó)倫敦的自然歷史博物館，請(qǐng)那里的研究人員幫助鑒定。然而博物館的研究人員搶先公布，這種蠅是一種在英國(guó)首次發(fā)現(xiàn)的新物種。這件事讓大學(xué)主持這一項(xiàng)目的教授非常惱火。自然他想做昆蟲(chóng)方向博士的夢(mèng)想也隨之破滅。不過(guò)，他幸運(yùn)地得到了當(dāng)時(shí)還是牛津大學(xué)動(dòng)物系教發(fā)育生物學(xué)講師Michael Fischberg博士的邀請(qǐng)，在他的名下攻讀博士學(xué)位。巧合的是Michael Fischberg博士導(dǎo)師的導(dǎo)師正是大名鼎鼎的諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Hans Spemann教授的學(xué)生。真可謂名師出高徒！1956年John Gurdon開(kāi)始了他的博士論文工作。Michael Fischberg博士建議他采用非洲爪蟾為試驗(yàn)動(dòng)物開(kāi)展體細(xì)胞核移植的研究，而不是延用北美豹蛙。因?yàn)楹捅泵辣芟啾龋侵拮傅姆敝称诟蹋粌H全年繁殖，而且可以超數(shù)排卵。在博士研究的開(kāi)始階段，John Gurdon花了一年的時(shí)間建立和完善蛙體細(xì)胞核移植的體系。他成功地改進(jìn)了蛙卵的去核效率，運(yùn)用紫外線照射的方法摧毀染色體，而不損傷卵子細(xì)胞質(zhì)本身，同時(shí)也克服了細(xì)胞膜外膠狀物對(duì)注射細(xì)胞時(shí)所產(chǎn)生的干擾。另外，他的導(dǎo)師發(fā)現(xiàn)了一個(gè)非洲爪蟾的突變型，使用這種突變體的卵子可以使去核的效率大大提高。這些改進(jìn)為后來(lái)的體細(xì)胞核移植的成功奠定了技術(shù)基礎(chǔ)［13］。此后，他將自己的全部熱情都投入到了試驗(yàn)中，并將Briggs的結(jié)果又向前推進(jìn)了一步。他采用蝌蚪的小腸上皮細(xì)胞作為核移植的供體細(xì)胞，將它移入去核的蛙未受精卵中，并成功地得到了正常發(fā)育的后代，并且這些后代可以發(fā)育至性成熟階段。他將這些結(jié)果以“可育的小腸細(xì)胞核”為題發(fā)表在《自然》雜志上［14］。這是發(fā)育生物學(xué)發(fā)展中一個(gè)具有劃時(shí)代意義的里程碑，它標(biāo)志著身體中所有的細(xì)胞都含有同樣完整的一套基因，從而回答了發(fā)育生物學(xué)中長(zhǎng)期懸而未決的重要問(wèn)題。同時(shí)也明確說(shuō)明卵子具有將體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胚胎細(xì)胞狀態(tài)的“魔力”。不僅如此，這種現(xiàn)象也引起了人們的極大興趣，并導(dǎo)致體細(xì)胞置換即核移植概念的產(chǎn)生。

盡管這些在兩棲動(dòng)物所取得的成績(jī)已經(jīng)說(shuō)明AugustWeissman早期的假說(shuō)是不正確的，然而JohnGurdon采用成年蛙的體細(xì)胞所作的核移植試驗(yàn)，盡管可以產(chǎn)生蝌蚪，但未能變成成蛙［15-16］。這暗示著非洲爪蟾體細(xì)胞核移植有一定的局限性。1950—1970年，胚胎發(fā)育學(xué)的發(fā)展包括精子獲能的發(fā)現(xiàn)、胚胎體外培養(yǎng)技術(shù)開(kāi)始建立，以及分子生物學(xué)特別是DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)，使得哺乳動(dòng)物的核移植成為了可能。人們很自然地提出，當(dāng)采用哺乳動(dòng)物的細(xì)胞核進(jìn)行核移植時(shí)，核移植的胚胎是否也遵循與兩棲動(dòng)物核移植同樣的規(guī)律呢？絕大多數(shù)科學(xué)家持悲觀或否定態(tài)度，因?yàn)閺倪M(jìn)化論的觀點(diǎn)來(lái)看哺乳動(dòng)物的基因與兩棲動(dòng)物的相比更“保守”。

4 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的核移植

在1960—1970年間，由于小鼠、兔、羊、牛和豬的超數(shù)排卵、卵子的回收以及胚胎移植等技術(shù)已經(jīng)廣泛被使用，同時(shí)，卵子和胚胎的體外培養(yǎng)技術(shù)也獲得了突破，這些都為哺乳動(dòng)物核移植工作的開(kāi)展創(chuàng)造了必要條件。1978年，波蘭生物學(xué)家Modlinski等首先將一個(gè)8-細(xì)胞期小鼠胚胎細(xì)胞核通過(guò)顯微操作的方法注射到一個(gè)完整的受精卵中，從而得到了發(fā)育到囊胚的4倍體胚胎［17］。此后，Modlinski采用了未受精卵做為供體核的受體細(xì)胞，但并未得到可發(fā)育的胚胎［18］。1981年，美國(guó)生物學(xué)家K.Illmensee和P.C.Hoppe［19］將小鼠內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞核注入到去核的小鼠受精卵中并產(chǎn)生了3只克隆的后代。但遺憾的是，這個(gè)結(jié)果并沒(méi)有能被重復(fù)。1984年，J.McGrath等［20］將小鼠發(fā)育后期胚胎卵裂球的核移入去核的受精卵中并不能支持核移植胚胎的體外發(fā)育。因此，根據(jù)現(xiàn)代哺乳動(dòng)物核移植技術(shù)的操作方法，哺乳動(dòng)物真正意義上的核移植成功是由美國(guó)發(fā)育生物學(xué)家J.McGrath和D.Solter［21］取得的。他們用滅活的仙臺(tái)病毒（Sendai virus）將小鼠1細(xì)胞受精卵的核與去核的受精卵融合，核移植細(xì)胞的存活率為90%，與對(duì)照組相比并沒(méi)有下降。當(dāng)將這些核移植胚胎植入受體后，其后代出生率與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯下降。但是隨著細(xì)胞核分化程度的不斷提高，如2-、4-、8-細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞核用于供體核時(shí)，核移植胚胎的發(fā)育率明顯下降。而用8-細(xì)胞胚胎以后的細(xì)胞核做為供體核時(shí)，甚至沒(méi)有核移植的胚胎發(fā)育至囊胚。此后，他們采用未受精卵做為供體核的受體細(xì)胞，但未能得到可發(fā)育的胚胎（因?yàn)楹艘浦驳募?xì)胞需要被激活后才能發(fā)育）。根據(jù)這些試驗(yàn)結(jié)果得到結(jié)論：通過(guò)簡(jiǎn)單的核移植進(jìn)行哺乳動(dòng)物的克隆在生物學(xué)上是不可能的。此后，哺乳動(dòng)物核移植技術(shù)有了較快的發(fā)展。如1987年R.S.Prather等［22］通過(guò)2-8細(xì)胞期牛胚胎卵裂球作為供體細(xì)胞核，將它移入體內(nèi)成熟、去核的卵母細(xì)胞中，移植后2只正常的犢牛順利誕生。幾乎在同一時(shí)間Y.Tsunoda等1987年［23］也通過(guò)移植4-8細(xì)胞小鼠胚胎的卵裂球到2細(xì)胞期去核的受精卵，成功地獲得了正常的后代。但他們用同樣的方法移植囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞核，并未得到可發(fā)育的胚胎。這些試驗(yàn)結(jié)果表明，使用受精卵與未受精卵用于受體細(xì)胞時(shí)核移植的效率是不同的。而未受精卵效率好像更高。因此，核移植技術(shù)中，去核的MⅡ時(shí)期卵母細(xì)胞被廣泛用于供體核的受體細(xì)胞。不過(guò)，正常情況下，受精卵的激活是由精子激發(fā)的，而當(dāng)采用去核的MⅡ卵母細(xì)胞為受體細(xì)胞時(shí)，由于核移植后的細(xì)胞沒(méi)有精子的參與，這樣的細(xì)胞必須要被人工激活的方法激活后才可獲得發(fā)育的能力。從技術(shù)角度來(lái)說(shuō)，這一變化使核移植方法變得更加復(fù)雜，技術(shù)也要求更高。從那時(shí)起，哺乳動(dòng)物核移植技術(shù)研究再次陷入了低谷。直到1995年，K.H.Campbell（全 名 Keith Henry Stockman Campbell，1954—2012）等［24］用綿羊囊胚體外培養(yǎng)9 d以上的細(xì)胞核成功地克隆了兩只健康的小羊，被命名為Morag（摩拉）和Megan（梅根）。緊接著1996年7月5日他們又用體外培養(yǎng)的胎兒成纖維細(xì)胞和6歲懷孕母羊乳腺細(xì)胞，采用同樣的方法又成功地克隆出健康的后代，其中就包括世界最著名的“多莉”［25］。在這項(xiàng)科學(xué)歷史性的突破中被稱(chēng)為科學(xué)奇才的K.H.Campbell作出了杰出的貢獻(xiàn)［26］。K.H.Camp-bell 1954年5月23日出生于英國(guó)中部城市伯明翰。盡管父母離異對(duì)年幼的他產(chǎn)生了很大的不良影響，但他從小就顯露聰穎的天賦，從中學(xué)到大學(xué)他都獲得了優(yōu)異的成績(jī)。他畢業(yè)于伯明翰愛(ài)德華國(guó)王11世男子中學(xué)（King Edward VI Grammar School）。1978年他畢業(yè)于倫敦伊麗莎白女王學(xué)院并獲得了微生物學(xué)的學(xué)士學(xué)位。在大學(xué)學(xué)習(xí)期間，他開(kāi)始對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及分裂的調(diào)控即細(xì)胞周期產(chǎn)生了濃厚的興趣，這也為他后來(lái)的科學(xué)研究打下了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。此后他又作為主要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員被派往南也門(mén)工作了一段時(shí)間?；貒?guó)后在英格蘭Surrey以居里夫人命名的研究所工作。1983年他獲得了“居里夫人獎(jiǎng)學(xué)金”，開(kāi)始了他在英國(guó)Sussex大學(xué)攻讀博士學(xué)位的研究工作。他的主要研究方向是酵母菌以及卵子早期發(fā)育時(shí)細(xì)胞質(zhì)與核的調(diào)控。1986年他順利獲得博士學(xué)位。那段時(shí)間他閱讀了大量的文獻(xiàn)，對(duì)于分化了的體細(xì)胞不可逆定律產(chǎn)生了懷疑。正像他所說(shuō)的，盡管他博士論文的主要研究對(duì)象是真核生物和兩棲類(lèi)的蛙，但他始終堅(jiān)信，很多適用于真核生物和兩棲類(lèi)的規(guī)律也可能適用于哺乳動(dòng)物。正是懷著這樣的夢(mèng)想，在經(jīng)歷了兩次博士后研究之后，他于1991年進(jìn)入了威爾慕特博士（Dr Ian Wilmut）領(lǐng)導(dǎo)的科研小組，開(kāi)始了他夢(mèng)寐以求的、具有創(chuàng)造性的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植的研究。向AugustWeissmann假說(shuō)的最后一個(gè)難題發(fā)起了挑戰(zhàn)。他將控制細(xì)胞周期理論創(chuàng)造性地應(yīng)用到哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移的研究當(dāng)中，為哺乳動(dòng)物的核移植技術(shù)帶來(lái)了史無(wú)前列的變革。多莉吸引了全世界人的目光。然而從技術(shù)角度而言，真正意義上的突破確是梅根和摩拉，而并非人們關(guān)注的多莉。因?yàn)槎嗬騼H僅是在前者基礎(chǔ)上的延續(xù)而已。1997年Campbell離開(kāi)了羅斯林研究所（The Roslin Institute）進(jìn)入英國(guó)PLL Therapeutics生物技術(shù)公司。在那里他將自己的理論和技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因的家畜生產(chǎn)上，特別是在克隆豬的研究中，他又一次向世人展現(xiàn)了自己的才華，他創(chuàng)造性地采用了兩次核移植的方法有效地克服了卵母細(xì)胞激活效率低的難題，為世界第一批體細(xì)胞克隆豬的成功做出了重要貢獻(xiàn)［27］。1999年他又離開(kāi)了PLL公司，受聘于英國(guó)諾丁漢大學(xué)，成為動(dòng)物生物技術(shù)及動(dòng)物干細(xì)胞研究的教授，直至2012年10月5日突然離世。這位年僅58歲的科學(xué)界巨星的隕落讓世人為之震驚，也讓后人為之惋惜。因?yàn)樵隗w細(xì)胞核移植領(lǐng)域所做出的突出貢獻(xiàn)，他曾先后多次獲獎(jiǎng)。2008年他和威爾慕特（Ian Wilnut）教授以及在誘導(dǎo)干細(xì)胞領(lǐng)域做出重大貢獻(xiàn)的日本胚胎干細(xì)胞科學(xué)家Shinya Yamanaka教授，被授予了“東方諾貝爾獎(jiǎng)”之稱(chēng)的Shaw獎(jiǎng)。

5 結(jié)語(yǔ)

多莉的出生給100多年前AugustWeissman的假說(shuō)以最完美的回答，即所有動(dòng)物（包括哺乳動(dòng)物）的細(xì)胞包括分化了的體細(xì)胞都具有相同的基因組，并且都具有重編程（reprogramming）重新回到胚胎初始狀態(tài)（totipotency）的潛力。為回答這個(gè)假說(shuō)無(wú)數(shù)科學(xué)家不斷探索和創(chuàng)新，終于為這一困擾人們一個(gè)多世紀(jì)的難題劃上了完美的句號(hào)，并為在此基礎(chǔ)上建立起來(lái)的干細(xì)胞生物學(xué)以及相關(guān)領(lǐng)域?qū)W科的發(fā)展翻開(kāi)了嶄新的一頁(yè)。毫無(wú)疑問(wèn)，這些為人類(lèi)科學(xué)事業(yè)做出巨大貢獻(xiàn)的科學(xué)家及他們?yōu)榭茖W(xué)事業(yè)所做出的成績(jī)將被人們永遠(yuǎn)銘記。他們?yōu)榭茖W(xué)事業(yè)忘我獻(xiàn)身的精神將激勵(lì)著一代又一代的年輕科學(xué)家為探索科學(xué)的真理而繼續(xù)奮斗。