馬楊君，崔 凱，鄒 琦，李和平*

（1.東北林業(yè)大學(xué) 野生動物與自然保護地學(xué)院，哈爾濱 150040；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 青島 266109）

1951年，美籍華人張明覺（Chang M C）［1］和澳大利亞科學(xué)家C.R.Austin［2］幾乎同時發(fā)現(xiàn)，哺乳動物精子必須在雌性生殖道內(nèi)經(jīng)歷一段成熟過程才能獲得受精能力。1952年，C.R.Austin將這一現(xiàn)象稱之為精子獲能（capacitation）。精子獲能現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是體外受精史上的一個里程碑。精子在受精前必須獲能，這是哺乳動物獨具的特性。因此精子體外誘導(dǎo)獲能是體外受精研究中必須首先解決的問題之一。

亞?；撬崾蔷哂袕V泛生理活性的物質(zhì)。L.E.Cornett等［3］和R.L.Mrsny等［4］最早發(fā)現(xiàn)，金黃地鼠精子在體外培養(yǎng)基中會很快死亡，但加入亞?；撬岷笄闆r獲得改善，存活時間顯著延長，為精子的體外獲能與受精創(chuàng)造了條件。

鹿是重要的經(jīng)濟動物，開展其受精生物學(xué)研究同樣具有重要科學(xué)意義，但目前有關(guān)亞?；撬釋ζ渚芋w外獲能的研究很少。本研究以馬鹿為試驗對象，開展了亞?；撬釋β咕芋w外獲能影響的研究，以期為亞?；撬嵩诼贵w外受精實踐中提供基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)參考。

1 材料方法

1.1 精液來源

馬鹿新鮮精液，以人工采精的方法采自同一頭成年健康種公鹿。采得的新鮮精液用稀釋液稀釋后，于0.25 mL細(xì)管中分裝，0～4℃保存（不超過5 d）。

1.2 試劑

Hypotaurine、BSA、肝素、Penicillin G、Streptomycin sulfate、NaCl、KCl、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgCl2·6H2O、Na2HPO4·7H2O、NaH2PO4、Na-Pyruvate、NaHCO3、Glucose、臺盼藍(lán)，均購自SIGMA公司；DMSO，AMRESCO 分裝；Phenol Red，購自ALDRICH公司；俾士麥棕Y，購自CHROMA公司；玫瑰紅B、戊二醛、乙醇，均為國產(chǎn)分析純。

1.3 精子體外獲能培養(yǎng)液

BO／TALP基礎(chǔ)液按照細(xì)胞培養(yǎng)用液的要求配制。洗精液為BO／TALP基礎(chǔ)液+6 mg／mL BSA，獲能液為BO／TALP基礎(chǔ)液+6 mg／mL BSA +10μg／mL肝素。溶液均在使用前配制，0.22μm濾器過濾除菌后，于CO2培養(yǎng)箱中平衡4 h以上使用。各種培養(yǎng)液均采用滅菌超純水配制。

1.4 試驗方案

采用上浮法，在獲能液BO／TALP基礎(chǔ)液+6 mg／mL BSA +10μg／mL肝素中，分別添加亞牛磺酸至終濃度為0，30，50，70，100，200μmol／L的濃度梯度，處理45 min，觀測體外獲能效果；并隨之制作培養(yǎng)滴，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于2，4，6，8 h后鏡檢，記錄精子活率，計算彎尾率。

2 結(jié)果

2.1 BO液中亞牛磺酸對精子獲能的影響

見表1。

表1 BO液中不同濃度亞牛磺酸對馬鹿精子體外獲能的影響

在BO液中使用不同濃度亞?；撬幔S著亞?；撬釢舛鹊脑黾?，精子活力、彎尾率逐漸提高。各添加組精子活力、彎尾率均顯著高于不添加組（P＜0.05）。亞牛磺酸濃度為200μmol／L的添加組精子活力最高，但與亞牛磺酸濃度為100μmol／L的添加組差異不顯著（P＞0.05），即亞牛磺酸濃度為100，200μmol／L的兩個添加組精子活力相當(dāng)。亞?；撬釢舛葹?00μmol／L的添加組精子彎尾率最高，顯著高于其他添加組（P＜0.05）。

2.2 TALP液中亞?；撬釋荧@能的影響

見表2。

表2 TALP液中不同濃度亞?；撬釋︸R鹿精子體外獲能的影響

在TALP液中使用不同濃度亞牛磺酸，各添加組精子活力、彎尾率均顯著高于不添加組（P＜0.05）。亞?；撬釢舛葹?00μmol／L的添加組精子活力最高，但與亞牛磺酸濃度為70μmol／L、100μmol／L的兩組差異不顯著（P＞0.05），即亞?；撬釢舛葹?0，100，200μmol／L的三組精子活力相當(dāng)。亞?；撬釢舛葹?00μmol／L的添加組精子彎尾率最高，顯著高于其他組（P＜0.05）。

2.3 時間與亞牛磺酸對精子活率的影響

2.3.1 BO液中亞?；撬釋踊盥实挠绊?見表3。

在BO液中添加不同濃度亞?；撬峥筛纳凭踊盥剩?～8 h期間精子活率均高于不添組，即添加亞牛磺酸可縮減精子活率的降低、延緩精子活率的降低速度。

2.3.2 TALP液中亞?；撬釋踊盥实挠绊?見表4。

表4 TALP液中亞?；撬釋踊盥实挠绊?/p>

在TALP液中添加不同濃度亞?；撬釋踊盥实挠绊懶Ч②厔菖c在BO液中的效果相似，但亞牛磺酸在TALP液中的效果總體優(yōu)于在BO液中的效果。

3 討論

精子獲能是所有哺乳動物精子受精前必須經(jīng)歷的一個生理階段［2］。早期人們采用精子體內(nèi)獲能的方法，從交配母獸的子宮中沖取獲能精子，再與卵子在體外實現(xiàn)受精［5］。但是體內(nèi)獲能常常受到很多條件的限制，為此亟待發(fā)展一種體外獲能的方法。于是研究者便使用各種動物的體液（如輸卵管液、濾泡液和血清）使精子在體外獲能［6］，但這些體液成分相當(dāng)復(fù)雜，很難確定何種成分參與誘發(fā)或支持精子獲能。1971年Y.Toyoda等［7］最先采用了一種特定的活性培養(yǎng)基使精子獲能并成功完成體外受精，自此分析體外精子獲能成為比較容易的事情。體外獲能技術(shù)可以較好地控制試驗條件，并可逐個分析獲能相關(guān)因子。目前使用的體外受精培養(yǎng)基和體外獲能培養(yǎng)基是在臺式液、Kerb-Ringer氏液和BO液基礎(chǔ)上添加適當(dāng)?shù)哪芰课镔|(zhì)，如葡萄糖、乳酸鹽、丙酮酸鹽和白蛋白等改良而來的，并用獲能誘導(dǎo)因子來誘導(dǎo)獲能和頂體反應(yīng)［8］。常用的獲能誘導(dǎo)因子有肝素、BSA、卵泡液、A23187等。

鹿精子體外獲能的研究還處在起步階段，現(xiàn)已有的研究表明以TALP、BO、HIS和mKRB為基礎(chǔ)液均可使馬鹿精子獲能，肝素和咖啡因等能有效促進(jìn)馬鹿精子獲能并完成體外受精［9］。

亞?；撬嶙鳛檎T導(dǎo)精子獲能的誘導(dǎo)因子，在其他動物如鼠、牛等已有研究報道，并已經(jīng)證明亞?；撬崾蔷哂袕V泛生理活性的物質(zhì)［3-5］，而且研究也證實，在獲能液中同時添加亞?；撬峥娠@著提高精子活率［10-11］。

為了探討亞?；撬釋︸R鹿精子體外獲能的誘導(dǎo)作用，本試驗采用上浮法，以獲能液BO／TALP基礎(chǔ)液+6 mg／mL BSA +10μg／mL肝素中，分別添加亞?；撬嶂两K濃度為0，30，50，70，100，200μmol／L濃度梯度的試驗設(shè)計，觀測了精子活力、彎尾率、精子活率，以此評價亞?；撬釋︸R鹿精子體外獲能的影響。取得的試驗結(jié)果為后續(xù)開展馬鹿體外受精等受精生物學(xué)研究提供了數(shù)據(jù)參考。