張曉鷹，劉興偉，張興會(huì)，黃國衛(wèi)，張立斌，武師良，王曉銘，鄒麗娜，宋恩吉

（1.遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心，沈陽 110000；2.遼寧省建平縣畜牧技術(shù)推廣總站，遼寧 建平 122400；3.建平縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 建平 122400；4.蓋州市畜牧技術(shù)推廣站，遼寧 蓋州 115200）

近年來，遼西驢以耐粗飼、出肉率高、肉質(zhì)鮮美、皮質(zhì)好、出膠率高等深受市場的青睞，飼養(yǎng)數(shù)量逐年增加，養(yǎng)殖量居全國前列，已成為我國重要的肉驢生產(chǎn)及供種基地。為了做好遼西驢品種資源的保護(hù)利用，同時(shí)解決缺少優(yōu)秀種驢等實(shí)際問題，遼西驢項(xiàng)目組于2019年6—8月開展了遼西驢細(xì)管冷凍精液的制作研究，并取得了良好成效。

1 材料與方法

1.1 精液來源

精液來源于建平縣芮林牧業(yè)有限公司的4頭種公驢。

1.2 試劑及藥品

無機(jī)鹽（分析純）、糖類、乙二醇、甘油［1］等試劑及抗菌素等。

1.3 試驗(yàn)器材

400～600 倍光學(xué)顯微鏡［2］、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、超低溫溫度儀、控溫冰箱、電子天平、0.5 mL與0.25 mL細(xì)管［3］等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 篩選冷凍稀釋液 冷凍稀釋液包括以乙二醇為防凍劑的初選配方，以等量甘油替代乙二醇為防凍劑的二次篩選配方，不同含量的防凍劑的優(yōu)化配方。各配方具體成分見表1、表2、表3。

表1 初選凍精稀釋液配方成分

表2 二次篩選凍精稀釋液配方成分

表3 優(yōu)化凍精稀釋液配方成分

1.4.2 稀釋液配制 原精離心液配制：蔗糖分析純?cè)噭?10 g，加純化水1 000 mL煮沸至蔗糖全部溶解。

冷凍稀釋液配制：準(zhǔn)桷稱量各配方中的基礎(chǔ)試劑，煮沸，溶解，制成溶液，常溫冷卻后加入抗菌素和卵黃，攪拌均勻。

1.4.3 精液離心與稀釋 原精經(jīng)紗布（6～8層）過濾［4］后，按1∶1體積比例加入離心液［5］，緩慢均勻混合后，裝入離心管，在（30±4）℃范圍內(nèi)以2 000 r／min［6］離心10min；離心后精液棄去上清液后在干凈的容器內(nèi)按1∶1～1∶2加入冷凍稀釋液，等溫緩慢混勻。

1.4.4 降溫平衡 稀釋后的精液放入緩沖容器內(nèi)，封口，進(jìn)行降溫平衡。

1.4.5 精液冷凍溫度 初凍溫度［7］分別設(shè)置為（90±5）℃、（100±5）℃、（110±5）℃、（120±5）℃、（130±5）℃、（140±5）℃共6組，當(dāng)凍精細(xì)管變成乳白色時(shí)全部浸入液氮中。

1.4.6 細(xì)管凍精解凍及質(zhì)量檢測(cè) 解凍后，在37℃環(huán)境下檢查活力、頂體完整率和存活時(shí)間［8］。

1.4.7 分析方法 采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析［8］，用LSD法多重比較各處理的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同的稀釋液初選配方冷凍效果比較（見表4）

表4 不同的稀釋液初選配方的冷凍效果

從表4可以看出：C1配方的解凍后活力、凍后頂體完整率均最高。據(jù)此，以C1配方為首選配方。

2.2 凍精稀釋液配方的第二次篩選（見表5）

從表5可以看出：用等量的甘油替代乙二醇作為防凍劑，冷凍后精子活力A2＞A1，B2＞B1，C2＞C1；解凍后精子的解凍完整率A2＞A1，B2＞B1，C2＞C1，凍精解凍后在38℃下存活時(shí)間A2＞A1，B2＞B1，C2＞C1。上述情況表明，采用等量的甘油替代乙二醇作為防凍劑可以提高遼西驢細(xì)管凍精的綜合質(zhì)量。

表5 第二次篩選的凍精稀釋液配方效果比較

2.3 優(yōu)化稀釋液配方中不同甘油濃度對(duì)凍精質(zhì)量的影響（見表6）

表6 不同甘油濃度對(duì)凍精質(zhì)量的影響

由表6可以看出：C23（甘油含量為5mL）冷凍后活力、凍后頂體完整率、存活時(shí)間都比其他組高，其中C23的精子冷凍后活力較C21相比差異極顯著（P＜0.01），與C22、C25相比差異顯著（P＜0.05），與C24比較差異不顯著（P＞0.05）；C23凍后頂體完整率與C21、C22、C25相比差異顯著（P＜0.05），與C24比較差異不顯著（P＞0.05）；精子解凍后38℃下存活時(shí)間以C23組最高，與C21比較差異極顯著（P＜0.01），與C22、C25比較差異顯著，C23與C24比較差異不顯著（P＞0.05）。綜上所述，甘油的添加量以5 mL最為適宜。

2.4 不同的冷凍溫度對(duì)冷凍效果的影響

使用C23配方配制稀釋液，對(duì)不同的初凍溫度下各組冷凍效果進(jìn)行比較結(jié)果見表7。

表7 不同的冷凍溫度對(duì)冷凍效果的影響

由表7可以看出：不同初凍溫度的冷凍結(jié)果存在微小的差異，冷凍后活力以（100±5）℃～（120±5）℃較好，但各組間差異不顯著。凍后的頂體完整率也存在同樣的規(guī)律。因此，可以初步判定初凍溫度應(yīng)控制在（90±5）℃～（140±5）℃的溫區(qū)內(nèi)，溫度過高或過低對(duì)冷凍結(jié)果均會(huì)造成不良影響。

2.5 不同的平衡時(shí)間對(duì)冷凍效果的影響

使用配方C23對(duì)原精進(jìn)行稀釋，利用冰箱低溫保存稀釋后的精液，將冰箱的溫度設(shè)置為2℃，降溫到2℃最短的時(shí)間為6 h，測(cè)定降溫平衡后不同時(shí)間的細(xì)管凍精的解凍效果，結(jié)果見表8。

由表8可以看出：精液稀釋后，在2℃下降溫平衡10 h效果最好，解凍后精子活力從高到低依次為平衡10，8，12，18，14，6，16 h。平衡10 h與平衡8，12 h間差異不顯著（P＞0.05），平衡10 h與平衡18，6，14 h間差異顯著（P＜0.05）；精子頂體完整率各組間差異不顯著（P＞0.05），但與精子解凍后活力的變化規(guī)律是相同的，即降溫平衡10 h效果最好，從高到低依次為平衡10，8，14，16，12，18，6 h。精子解凍后38℃下存活時(shí)間以平衡10 h最長，18 h最短。由此所見，精液降溫平衡時(shí)間過長或較短都不好，以6～12 h為宜，與山羊凍精平衡適宜時(shí)間（2～4 h）有較大區(qū)別。

表8 降溫平衡時(shí)間對(duì)細(xì)管凍精效果的影響

2.6 不同的平衡溫度對(duì)冷凍效果的影響

使用配方6對(duì)原精進(jìn)行稀釋，將控溫冰箱的溫度分別調(diào)整到0，2，4～5℃（允許上下波動(dòng)0.5℃），通過調(diào)整溫度緩沖容器內(nèi)的細(xì)管精液量和包裹物層數(shù)等方法，使每份稀釋后的細(xì)管精液在10 h降溫到0℃和4℃，待溫度穩(wěn)定后進(jìn)入冷凍程序操作，比較解凍后的精子活力及頂體完整率的變化，結(jié)果見表9。

表9 不同平衡溫度對(duì)冷凍效果的影響

從表9可以看出：平衡溫度以0℃組解凍后精子活力最好，其次為2℃組，4～5℃組最低，0℃組與其他兩組間差異顯著（P＜0.05）；頂體完整率比較，三組之間差異均不顯著（P＞0.05）。解凍后38℃下存活時(shí)間，以0℃下平衡最長，4～5℃平衡時(shí)最短。可見在0℃下進(jìn)行精液降溫平衡，可以取得較好的冷凍效果。

2.7 不同的解凍溫度對(duì)細(xì)管凍精質(zhì)量的影響試驗(yàn)

將生產(chǎn)的同一批次的細(xì)管凍精按照試驗(yàn)要求分組，再使用不同溫度的熱水進(jìn)行解凍，觀察精子的存活情況，結(jié)果見表10。

由表10可以看出：遼西驢細(xì)管凍精解凍后活力、頂體完整率和解凍后在38℃存活時(shí)間各項(xiàng)指標(biāo)隨著解凍溫度的提高而增加，表明高溫解凍有利于精子的凍后復(fù)蘇。考慮38℃、40℃解凍的各項(xiàng)指標(biāo)與＞40℃解凍的各項(xiàng)指標(biāo)差異性不大；高溫解凍需要操作者操作快速、反應(yīng)靈敏、對(duì)解凍的時(shí)間掌握得準(zhǔn)確及時(shí)，才能收到好的效果；高溫解凍在生產(chǎn)現(xiàn)場水溫的保持有一定的困難，因此，以38～40℃的溫水解凍為宜。

表10 不同的解凍溫度對(duì)驢細(xì)管凍精質(zhì)量的影響

2.8 不同容量細(xì)管精液冷凍效果比較（見表11）

由表11可以看出，0.25 mL細(xì)管與0.5 mL細(xì)管盛裝遼西驢精液進(jìn)行冷凍后，兩組之間的解凍后活力、頂體完整率、解凍后在38℃存活時(shí)間等均無差異，說明二者可以通用。

表11 0.5 m L和0.25 m L細(xì)管凍精冷凍效果比較

3 結(jié)論與討論

1）研究結(jié)果表明，以甘油為冷凍劑的配方（葡萄糖1.2 g、檸檬酸1.3 g、Tris 2.4 g、甘油5 mL、卵黃20 mL、雙蒸水70 mL、青鏈霉素各1×105IU）可為制作遼西驢細(xì)管冷凍精液的首選配方。

2）精液降溫平衡以時(shí)間8～12 h、溫度0～2℃的冷凍效果最好；精液初凍溫度在（90±5）℃～（140±5）℃的溫區(qū)內(nèi)冷凍效果最好。

3）冷凍精液解凍時(shí)，隨著解凍溫度的提高解凍效果也隨著提高，建議以38～40℃的溫水解凍較為適宜。

4）0.5 mL和0.25 mL細(xì)管凍精冷凍和解凍效果無差異，在生產(chǎn)實(shí)踐中建議0.5 mL細(xì)管為宜。

本研究因季節(jié)限制沒進(jìn)行細(xì)管凍精受胎率試驗(yàn)，有待于進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。