王 皓，鄭 鵬，王 雪，Adegoke E O，黃富碩，馬銘鈞，張貴學(xué)

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，哈爾濱 150030）

防御素（Defensins）是一類不含糖鏈的堿性陽離子多肽，廣泛分布于動(dòng)植物界，富含6個(gè)半胱氨酸結(jié)構(gòu)和3對分子內(nèi)二硫鍵［1-5］。防御素具有多方面的免疫功能，對細(xì)菌、病毒和部分寄生蟲都有滅殺作用，不但是先天性免疫組成部分還參與適應(yīng)性免疫［6］。人類表達(dá)α-防御素和β-防御素［7］。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人類α-防御素6種；β-防御素31種［8］，其中6種（HBD1-6）已經(jīng)被證明［9-11］。人類防御素主要表達(dá)于與外界相接觸或相通的各種黏膜細(xì)胞，例如呼吸道、胃腸道、泌尿道、生殖道以及皮膚等［10］。研究表明，防御素水平經(jīng)常在感染炎癥或組織損傷的反應(yīng)中發(fā)生改變［3，12］，表明防御素在免疫調(diào)節(jié)作用中發(fā)揮作用。

雙抗具有殺菌作用，可以直接添加到細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)，具有抑制細(xì)菌生長、避免細(xì)胞污染的作用。同時(shí)抗生素也是一種細(xì)胞毒素，其是否會(huì)直接作用于有機(jī)體組織細(xì)胞，導(dǎo)致天然防御應(yīng)答鮮見報(bào)道。故本試驗(yàn)意在通過青霉素和鏈霉素兩種抗生素處理Hela細(xì)胞，探究抗生素對子宮頸上皮細(xì)胞DEFA1和DEFB1表達(dá)的影響，為抗生素刺激細(xì)胞的天然防御提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

Hela細(xì)胞株，ATCC編號CCL-2；DMEM高糖培養(yǎng)基，美國Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清（FBS），美國ScienCell公司產(chǎn)品；PBS和胰蛋白酶，均為Solarbo公司產(chǎn)品；DMSO，購自美國Sigma公司；青霉素鈉和硫酸鏈霉素，購自碧云天生物技術(shù)公司；孕烯二酮（孕酮）和17-β雌二醇，購自Sigma公司；Trizol，美國Ambion公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，加拿大Abm公司產(chǎn)品；PCR試劑盒，TakaRa公司產(chǎn)品；電泳所用TAE，納川生物技術(shù)公司產(chǎn)品；瓊脂糖為Biowest公司產(chǎn)品；引物，由吉林庫美生物科技公司合成；熒光定量試劑盒FastStart Universal SYBR Green Master（ROX），Roche公司產(chǎn)品；RIPA裂解液，Thermo Fisher公司產(chǎn)品；SDS-PAGE電泳液，Solarbo 公 司 產(chǎn) 品；1.5 mol／L Tris- HCl（pH＝8.8），Solarbo公司產(chǎn)品；配制TBST所用1.0 mol／L Tris-HCl（pH＝8.0），Solarbo公司產(chǎn)品；1.0 mol／L Tris-HCl（pH＝6.8），Solarbo公司產(chǎn)品；四甲基乙二胺（TEMED），Biosharp公司產(chǎn)品；抗體，購自Proteintech公司；ECL發(fā)光試劑盒，南京諾維贊生物科技有限公司產(chǎn)品；膜再生液，購自Solarbo公司。

1.2 雙抗母液配制

按照青霉素（P）10 kU／mL+鏈霉素（S）10 mg／mL配制青霉素-鏈霉素混合溶液（PS），用0.22μm濾器過濾除菌，將配好的雙抗母液分裝至小瓶后-20℃保存，備用。后面試驗(yàn)中1%雙抗即為100 U／mL青霉素+0.1 mg／mL鏈霉素的青鏈霉素混合液，5%雙抗同理。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含有10%血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫恒濕培養(yǎng)Hela細(xì)胞。細(xì)胞生長至80% ～90%匯合度時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代繼續(xù)培養(yǎng)，以供后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.4 細(xì)胞處理

1.4.1 不同濃度的雙抗培養(yǎng)Hela細(xì)胞 將生長狀況良好的Hela細(xì)胞按照1×106個(gè)／孔接種到六孔板中，待Hela細(xì)胞貼壁后分別用含無雙抗、1%雙抗和5%雙抗的培養(yǎng)液（FBS濃度為10%）培養(yǎng)處理Hela細(xì)胞。48 h后，用熒光定量PCR檢測DEFA1和DEFB1的表達(dá)。

用Western Bolt測定DEFA1蛋白的表達(dá)情況。收集細(xì)胞加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心，提取蛋白上清液，加入loading buffer，100℃煮樣5 min，上樣，電泳，分離，轉(zhuǎn)膜至含50 g／L脫脂奶粉的TBST，室溫封閉濾膜1 h，一抗β-actin（1∶4 000），DEFA1（1∶150）4℃孵育過夜。在搖擺式搖床上用TBST清洗PVDF膜3次后，室溫孵育二抗2 h（1∶3 000），TBST清洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影成像，使用Image J對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.4.2 無雙抗培養(yǎng)Hela細(xì)胞后不同時(shí)間DEFA1和DEFB1表達(dá)的影響 由于Hela細(xì)胞長期在雙抗培養(yǎng)和保存環(huán)境中，故從相反的角度確定雙抗對DEFA1和DEFB1表達(dá)的影響。將生長狀況良好的Hela細(xì)胞按照1×106個(gè)／孔接種到六孔板中，待Hela細(xì)胞貼壁后用不含雙抗的培養(yǎng)液培養(yǎng)。分別在24 h、48 h、72 h后收細(xì)胞。用熒光定量PCR檢測DEFA1和DEFB1的表達(dá)，Western Bolt測定DEFA1蛋白的表達(dá)情況，方法同1.4.1。

1.4.3 雙抗對Hela細(xì)胞DEFA1和DEFB1表達(dá)的影響 將生長狀況良好的Hela細(xì)胞按照1×106個(gè)／孔接種到六孔板中，待Hela細(xì)胞貼壁后分別用含無雙抗、1%青霉素、1%鏈霉素的培養(yǎng)液分別培養(yǎng)。48 h后收細(xì)胞，用熒光定量PCR檢測DEFA1和DEFB1的表達(dá)，Western Bolt測定DEFA1蛋白的表達(dá)情況，方法同1.4.1。

1.5 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GeneBank中人β-actin基因（登錄號為X00351.1）防御素alpha1（DEFA1）和防御素beta1（DEFB1，登錄號為NM_004084.3，NM_005218.3），用Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)特異性引物。其中β-actin為內(nèi)參基因，引物序列見表1。引物由吉林庫美生物科技有限公司合成。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

ΔCt＝目的基因的Ct值-內(nèi)參基因的Ct值。

ΔΔCt＝（試驗(yàn)組目的基因Ct值-試驗(yàn)組內(nèi)參基因Ct值）-（對照組目的基因Ct值-對照組內(nèi)參基因Ct值）。

目的基因相對表達(dá)量＝2-ΔΔCt。

2 結(jié)果

2.1 Hela細(xì)胞鏡下觀察

無雙抗培養(yǎng)24，48，72 h后，用倒置顯微鏡放大100倍后觀察結(jié)果見圖1。

2.2 雙抗對Hela細(xì)胞防御素的影響

2.2.1 雙抗對DEFA1的影響 見圖2、圖3。QPCR結(jié)果表明，1%、5%雙抗處理組與對照組相比，Hela細(xì)胞的DEFA1表達(dá)差異顯著（P＜0.05）。Western結(jié)果表明，與定量檢測結(jié)果相符合。

2.2.2 雙抗對DEFB1的影響 見圖4。從qPCR結(jié)果可以看出，隨著青霉素、鏈霉素混合液濃度的增加，DEFB1基因表達(dá)量逐漸升高，濃度為5%時(shí)DEFB1表達(dá)量最高，三組之間均差異顯著（P＜0.05）。說明微生物毒素對防御素的表達(dá)有促進(jìn)作用。

2.3 無雙抗培養(yǎng)Hela細(xì)胞不同時(shí)間Hela細(xì)胞防御素的變化

2.3.1 無雙抗培養(yǎng)不同時(shí)間對DEFA1的影響 見圖5、圖6。qPCR結(jié)果表明，無雙抗培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，DEFA1基因表達(dá)量逐漸降低，在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h之間差異顯著（P＜0.05）。

蛋白結(jié)果表明，無雙抗培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)到72 h時(shí)，DEFA1的蛋白表達(dá)量基本不變，與定量結(jié)果不一致。

2.3.2 無雙抗培養(yǎng)不同時(shí)間對DEFB1的影響 見圖7。qPCR結(jié)果表明，無雙抗培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，DEFB1基因表達(dá)量在培養(yǎng)24 h和48 h時(shí)無差異，72 h和前兩組差異顯著（P＜0.05）。

2.4 單獨(dú)加入青霉素和鏈霉素培養(yǎng)Hela細(xì)胞

2.4.1 青霉素和鏈霉素對DEFA1的影響 見圖8、圖9。qPCR結(jié)果顯示，使用1%青霉素和1%鏈霉素分別處理Hela細(xì)胞，DEFA1基因表達(dá)量均顯著高于對照組（P＜0.05），1%青霉素處理組的DEFA1表達(dá)量高于1%鏈霉素處理組。蛋白表達(dá)結(jié)果表明，1%青霉素處理組和1%鏈霉素處理組DEFA1蛋白表達(dá)量均高于對照組。

2.4.2 青霉素和鏈霉素對DEFB1的影響 見圖10。qPCR結(jié)果顯示，1%青霉素和鏈霉素處理組的DEFB1基因表達(dá)顯著均高于對照組（P＜0.05）。說明青霉素和鏈霉素均能促進(jìn)防御素DEFB1的表達(dá)。

3 討論

青霉素是一種真菌毒素，蘇格蘭科學(xué)家亞歷山大弗萊明在1928年發(fā)現(xiàn)了青霉素［13］，1942年被人們利用來治療感染［14］。鏈霉素是1943年被賽爾曼在灰色鏈霉菌的提取物中發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)菌毒素［15］，對某些微生物，如結(jié)核桿菌有特效，是繼青霉素之后第二個(gè)被大量生產(chǎn)并廣泛應(yīng)用的抗生素。

3.1 青霉素和鏈霉素單獨(dú)處理對防御素的影響

從圖8～10的結(jié)果可知，青霉素和鏈霉素均能促進(jìn)兩種防御素（DEFA1和DEFB1）的表達(dá)，在青霉素或鏈霉素的作用下先天性免疫機(jī)制被觸發(fā)［6］，產(chǎn)生防御素，防御素作為生殖道的第一道天然防御屏障發(fā)揮多種作用［6］。

3.2 雙抗對防御素的影響

圖2～4的結(jié)果表明，隨著雙抗?jié)舛鹊脑黾?，DEFA1和DEFB1表達(dá)量均顯著升高。由此可見，作為微生物的毒素可以激發(fā)天然防御機(jī)能。面對外源病菌刺激時(shí)，子宮頸上皮細(xì)胞通過產(chǎn)生防御素［6］防御外源刺激，且隨著刺激強(qiáng)度的增加子宮頸上皮細(xì)胞防御素的分泌也會(huì)增加。

3.3 無雙抗培養(yǎng)不同時(shí)間Hela細(xì)胞防御素的變化

圖5、圖7的結(jié)果表明，隨著抗生素刺激的消失，在mRNA水平DEFA1和DEFB1表達(dá)量下降，即轉(zhuǎn)錄停止，而圖6的蛋白結(jié)果顯示，在抗生素刺激消失的72 h內(nèi)DEFA1蛋白水平表達(dá)量不變，即翻譯還在繼續(xù)。這表明在抗生素刺激消失一段時(shí)間之內(nèi)，子宮頸上皮細(xì)胞防御素不會(huì)立即消失，仍然有防御能力。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入的雙抗為青霉素和鏈霉素按照一定比例的混合液。綜合以上結(jié)果，細(xì)胞培養(yǎng)中加入雙抗防止污染，雙抗的作用除了青霉素和鏈霉素二種抗生素本身的直接殺菌作用外，還能刺激細(xì)胞產(chǎn)生防御素。

4 結(jié)論

青霉素和鏈霉素除了有直接殺菌作用外，雙抗可促進(jìn)子宮頸細(xì)胞天然防御反應(yīng)，刺激細(xì)胞產(chǎn)生防御素間接殺菌。