劉學(xué)峰，李信濤，佟桂芝*，朱 貴，王偉霞，海 龍

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧科學(xué)分院，吉林 公主嶺 136100）

美利奴羊是細(xì)毛綿羊品種的統(tǒng)稱，在世界各地廣泛飼養(yǎng)，多年后衍生出了諸多毛用、毛肉兼用、肉毛兼用品種。德國(guó)美利奴羊是我國(guó)自20世紀(jì)50年代起就開始引進(jìn)養(yǎng)殖的優(yōu)秀肉毛兼用品種，在生長(zhǎng)周期、繁殖性能、適應(yīng)性、產(chǎn)肉性能上均有良好的表現(xiàn)，養(yǎng)殖實(shí)踐中也已經(jīng)與多種細(xì)毛雜種羊和本地羊嘗試雜交以進(jìn)一步改良品種。針對(duì)德國(guó)美利奴羊肉質(zhì)上的不足，使用分子標(biāo)記高效篩選優(yōu)良肉質(zhì)個(gè)體用于繁殖和育種，是進(jìn)一步改善德國(guó)美利奴羊品種的高效途徑［1］。

肌內(nèi)脂肪（IMF）是羊肉肌肉風(fēng)味的主要指標(biāo)之一［2］。在正常范圍內(nèi)，肌內(nèi)脂肪含量與羊肉的鮮嫩度、口感風(fēng)味和多汁性呈直接正相關(guān)關(guān)系［3-5］，肌纖維之間沉積一定量脂肪時(shí)大理石紋增加，肉質(zhì)鮮嫩性和多汁性得到改善［6］。研究表明，遺傳上肌內(nèi)脂肪含量與瘦肉率呈負(fù)相關(guān)，因此，培育高瘦肉率兼高肌內(nèi)脂肪含量（即肉質(zhì)口感良好）的羊品種理論上完全可行。但羊（特別是具體品種羊）的肌內(nèi)脂肪含量分子標(biāo)記的篩選工作目前開展尚不多。肌內(nèi)脂肪含量和脂肪酸組成對(duì)綿羊肉品質(zhì)有影響［7-8］。脂肪的硬度受肌內(nèi)脂肪及脂肪酸組成等影響，進(jìn)而影響脂肪的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味以及食用品質(zhì)，而脂肪酸組成受動(dòng)物種類、品種、性別等因素影響［9］。羊肌內(nèi)脂肪含量是影響羊肉品質(zhì)的一個(gè)重要因素，其調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，主要受營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境和遺傳等多方面的影響，其中基因調(diào)控是改善羊肌內(nèi)脂肪沉積的根本途徑之一［10］。

1 德國(guó)美利奴羊CAPN1和CAPN2（鈣蛋白酶1和鈣蛋白酶2）多態(tài)性位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)

CAPN是一種細(xì)胞內(nèi)普遍存在的巰基丙氨酸蛋白內(nèi)切酶?，F(xiàn)有研究表明，CAPN（特別是CAPN1）在某些牛和羊種類中與肉嫩化過程相關(guān)。試驗(yàn)擬以此為基礎(chǔ)，研究德國(guó)美利奴羊CAPN多態(tài)性及其與肌內(nèi)脂肪的關(guān)聯(lián)。

試驗(yàn)動(dòng)物選擇自有養(yǎng)羊場(chǎng)內(nèi)健康、成年純種德國(guó)美利奴羊355只，屠宰前頸靜脈采血5 mL，加入含抗凝劑的離心管中保存于-20℃。屠宰后取背最長(zhǎng)肌肉樣于-80℃保存。

采用索氏抽提法，檢測(cè)羊背最長(zhǎng)肌肉樣的肌內(nèi)脂肪含量：1）將3～5 g樣品在液氮中研至細(xì)粉，裝入稱重過的烘干濾紙包中，稱含濕樣的濾紙包重，干燥2 h后稱含干樣的濾紙包重；2）使用索氏抽提器室溫下乙醚抽提6 h；3）乙醚揮發(fā)后，將濾紙包干燥2 h后稱重。計(jì)算公式：肌內(nèi)脂肪含量＝（含干樣濾紙包重-抽提后干燥濾紙包重）／（含濕樣濾紙包重-濾紙包干重）。

分子生物學(xué)試驗(yàn)部分委托北京微閱基因技術(shù)有限公司進(jìn)行。

使用酚-氯仿法提取血液樣品DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度后保存于-20℃。

根據(jù)GenBank上綿羊CAPN1和CAPN2的序列信息（NM_001127267和NM_001112817，見本申請(qǐng)SEQ ID NO.1-4）使用Primer Premier 5.1設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增，并進(jìn)行PCR-SSCP分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CAPN1上C724A（Leu-Met，均為非極性氨基酸）和CAPN2上A601G（Thr-Ala，由極性氨基酸變?yōu)榉菢O性氨基酸）兩個(gè)與肌內(nèi)脂肪相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)。

2 多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率

見表1。

表1 CAPN1上C724A和CAPN2上A601G的基因型頻率和等位基因頻率 %

德國(guó)美利奴羊群在兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。CAPN1上C724A屬于低度多態(tài)性位點(diǎn)，CAPN2上A601G屬于中度多態(tài)性位點(diǎn)。

3 不同基因型與肌內(nèi)脂肪含量的關(guān)聯(lián)

見表2。

表2 不同基因型與肌內(nèi)脂肪（背最長(zhǎng)?。┖康年P(guān)聯(lián) %

兩個(gè)位點(diǎn)背最長(zhǎng)肌肌內(nèi)脂肪含量最小二乘均值的關(guān)系分別為CC＜CA＜AA，AA＜AG＜GG，CAPN1 724位置處AA與CC、CA與CC之間均差異極顯著（P＜0.01），CAPN2 601G位置處GG與AA之間差異極顯著（P＜0.01），而AG與AA之間差異不顯著（P＞0.05）。說明兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)均有較好的作為品種培育分子標(biāo)記的潛力。

4 多態(tài)性分子標(biāo)記用于德國(guó)美利奴羊品種培育實(shí)踐

確定多態(tài)性位點(diǎn)后，將種羊頸靜脈采血樣本送至北京微閱基因技術(shù)有限公司，以SEQ ID NO.5-8的引物擴(kuò)增后測(cè)序檢測(cè)CAPN1上C724A和CAPN2上A601G處基因型。以基因型為標(biāo)準(zhǔn)選取CAPN 1 724位置上基因型為AA和CAPN 2 601位置上基因型為GG的種公羊3只、母羊25只，CAPN 1 724位置上基因型為CA和CAPN 2 601位置上基因型為GG的種公羊4只，將上述公羊和母羊用于自然交配繁殖。統(tǒng)計(jì)6月齡時(shí)樣本中背最長(zhǎng)肌和臀大肌中肌內(nèi)脂肪，平均值為（9.67±0.31）%、（5.75±0.25）%。從經(jīng)驗(yàn)上看，超過本實(shí)驗(yàn)室之前所養(yǎng)德國(guó)美利奴羊同期水平（約1.6%和0.7%），口感得到了一定提升，同時(shí)體重、羊毛等性狀無顯著變化。雖然尚未得到完全成年后的肌內(nèi)脂肪數(shù)據(jù)，但本研究分子標(biāo)記輔助選擇的實(shí)踐效果也已經(jīng)較為明確。

5 結(jié)論

CAPN1和CAPN2上的兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)C724A和A601G與羊肉肌內(nèi)脂肪相關(guān)，可作為肉羊新品種群選育中的分子標(biāo)記參考。