孫劍玥， 解玉， 徐亞娜

上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院)兒科(上海 200062)

支氣管哮喘屬于過敏性疾病中常見且較為嚴重的一種，該疾病常見的臨床表現(xiàn)為咳嗽、胸悶與發(fā)作性喘息，常伴各種并發(fā)癥如呼吸衰竭、肺氣腫等，甚至導(dǎo)致患者死亡[1]。研究證明該疾病主要與氣道炎癥、氣道可逆性阻塞有關(guān)，其發(fā)病機制為白三烯與其他炎癥介質(zhì)共同作用于氣道，導(dǎo)致患者出現(xiàn)氣道高反應(yīng)性、平滑肌痙攣、氣道重塑等各種氣道炎癥等[2]。對于呼吸科醫(yī)師來說，對氣道重塑與氣道炎癥的預(yù)防十分困難。相關(guān)研究表示，在支氣管哮喘的發(fā)病因素中，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Tregs)的作用十分重要[3]，其可對免疫細胞的功能進行調(diào)節(jié)。當(dāng)前對于孟魯司特的研究主要集中于其在哮喘疾病中的抗炎作用，在其對CD4+CD25+Tregs的影響方面研究不足。因而本文主要研究孟魯司特鈉這一白三烯受體拮抗劑對Tregs及各種效應(yīng)因子白細胞介素(IL)-5、γ干擾素(IFN-γ)水平的影響，對該藥物治療哮喘機制進行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)后，選取2016年3月至2017年6月于我院就診的94例支氣管哮喘急性發(fā)作期患兒為研究對象，其中患兒年齡為4～8歲，平均(6.64±1.36)歲；男44例，女50例；病程6～25 d，平均(22.34±9.07)d；既往喘息28例，既往過敏性疾病65例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)以我國權(quán)威機構(gòu)發(fā)布的《兒童支氣管預(yù)防指南》為標(biāo)準(zhǔn)，所納研究對象均需符合其中有關(guān)支氣管哮喘的診斷指標(biāo)[4]；(2)所有患兒在治療前1個月未使用過糖皮質(zhì)激素；(3)此前從未使用過白三烯拮抗劑；(4)患兒監(jiān)護人均需簽署相關(guān)知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：對于合并其他重大疾病，如吸入性激素過敏、呼吸道或全身感染性疾病、嚴重全身性疾病、精神異常及其他重要臟器如心肝脾肺腎等疾病的患兒應(yīng)排除在外。

按照隨機數(shù)字表法將患兒分為對照組與觀察組，每組47例。兩組患兒的性別、年齡、病程等情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，有可比性。見表1。

1.2 主要試劑與儀器 CD4-FITC、CD3-PC5、CD19-FITC、CD25-PE、CD23-PE單克隆抗體；IFN-γ檢測試劑盒、IL-5(上海晶美生物工程公司)；肺功能機(美國偉康公司)；流式細胞儀、溶血制備儀(美國Beckman Coulter)；酶標(biāo)儀、洗板機(美國DYNEX MRX)；酶標(biāo)板(丹麥Nunc-immuno plate)。

表1兩組患兒一般情況比較

項目例數(shù)性別(例)男女年齡(歲)病情嚴重程度(例)重度中度病程(d)對照組4721266.75±1.47321522.15±5.08觀察組4723246.50±1.03331423.79±6.172/t值0.1710.9550.0501.407P值>0.05>0.05>0.05>0.05

1.3 方法

1.3.1 治療方法 所有患兒入院后首先行常規(guī)檢查，之后予其基礎(chǔ)治療，如解痙、吸氧、抗感染、化痰等，保證患兒飲食的清淡。在治療用藥上，對照組：給予布地奈德混懸液0.5 mg/2 mL霧化吸入治療，1次/d，4周為1個療程；觀察組：在對照組用藥的基礎(chǔ)上，加服孟魯司特咀嚼片5 mg，1片/d，4周為1個療程。用藥過程中定期為患兒進行體檢，對其用藥前后疾病癥狀的變化進行詳細記錄。

1.3.2 肺功能評價 使用肺功能機測量患兒的肺功能情況，主要包括以下指標(biāo)：肺活量(FVC)、第1秒用力呼吸率(FEV1/FVC)、第1秒用力呼氣量(FEV1)等。安排專人將肺功能機的操作步驟與原理演示給患兒家長，由家長進行測量。

1.3.3 血清IL-5、IFN-γ水平測定 分別于治療前及治療后3個月對患兒血清IFN-γ與IL-5的水平進行測量，選用的測量方法為酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法。采集患兒血液標(biāo)本，其采集的血液應(yīng)為前臂的外周血，采集5 mL的血液以3 000 r/min的離心速度進行離心，時間為15 min，然后去其上清液，在溫度為-80 ℃的溫度下進行保存?；純褐委熐凹爸委?個月隨訪時采集前臂外周血5 mL，將5 mL的抗凝血分成兩份，分別標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，然后將100 μL的標(biāo)品和50 μL的酶標(biāo)記溶液加入到酶標(biāo)記板中，將其反應(yīng)90 min，反應(yīng)溫度為18～25 ℃，用洗扳機對其進行每次20 s的清洗，然后將50 μL的A、B底液加入到酶標(biāo)板中，反應(yīng)15 min，在避光且溫度為18～25 ℃的條件下進行，最后加入50 μL的終止液停止其反應(yīng)。使用5 mL抗凝血分別對樣品及標(biāo)準(zhǔn)品進行標(biāo)記，之后加入酶標(biāo)記溶液50 μL于酶標(biāo)板相應(yīng)位置，再在此位置分別加入100 μL的樣品與標(biāo)準(zhǔn)品，之后將酶標(biāo)板放置在溫度為18～25 ℃的環(huán)境中，反應(yīng)時長為90 min，之后進行5次清洗，每次清洗需靜置20 s，清洗之后于酶標(biāo)板中分別加入底液A、B，每個單位50 μL，對其進行光密度(OD)的測量并依據(jù)OD值進行IFN-γ與IL-5水平的確定。

1.3.4 外周血CD4+CD25+Tregs百分比測定 患兒于治療前與治療后3個月分別采其前臂外周血5 mL，使用流式細胞儀對其血中CD4+CD25+Tregs的百分比進行測量。對血樣進行離心，轉(zhuǎn)速選擇3 000 r/min，時間為15 min，然后提取上清液。對照組為小鼠抗體，觀察組為使用多色熒光抗體標(biāo)記的CD4、CD25，將兩者進行混合，在溫度為18～25 ℃的避光條件下，取抗凝全血100 μL，孵育15 min，然后Q-prep溶血制備儀對抗凝全血進行直接測定，在每份標(biāo)本為5 000個細胞的情況下，計算出外周血CD4+CD25+Tregs的百分比。

1.3.5 日間、夜間癥狀評分 依據(jù)患兒日間與夜間哮喘癥狀表現(xiàn)的不同，評價癥狀程度得出分數(shù)[6]。夜間癥狀評分標(biāo)準(zhǔn):(1)因哮喘持續(xù)發(fā)作無法睡眠記3分；(2)因哮喘癥狀發(fā)作經(jīng)常憋醒記2分；(3)因哮喘癥狀憋醒1次記1分；(4)夜間無癥狀記0分。日間癥狀評分標(biāo)準(zhǔn)：(1)哮喘持續(xù)發(fā)作記3分；(2)頻繁發(fā)作記2分；(3)哮喘癥狀較輕記1分；(4)無哮喘癥狀記0分。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 選擇 SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析研究所得數(shù)據(jù)，用百分率表示計數(shù)資料，對其進行2檢驗；用表示計量資料，用t檢驗對其進行分析比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒治療前后肺功能指標(biāo)比較 相比于治療前來說，治療后兩組患兒肺功能指標(biāo)均改善明顯，觀察組變化程度更加明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2治療前后肺功能指標(biāo)比較

項目例數(shù)FEV1/FVC(%)FEV1(L)FVC(L)治療前治療后治療前治療后治療前治療后對照組4761.3±12.562.8±13.21.5±0.61.5±0.51.9±0.52.1±0.4觀察組4760.2±13.470.2±13.51.4±0.51.8±0.42.0±0.42.4±0.3t值0.4122.6870.8783.2121.0714.113P值>0.05<0.05>0.05<0.05>0.05<0.05

2.2 兩組患兒治療前后日間、夜間癥狀評分比較 與治療前相比，治療后兩組患兒的日間與夜間的癥狀評分均下降顯著，且觀察組變化程度更大(P<0.05)。見表3。

表3 治療前后夜間與日間癥狀評分比較 分

2.3 兩組患兒治療前后血清IFN-γ和IL-5水平比較 相比于治療前，治療后患兒的IFN-γ水平整體有升高趨勢，而IL-5水平呈下降趨勢，且與對照組相比，觀察組變化顯著(P<0.05)。見表4。

2.4 兩組患兒治療前后外周血CD4+CD25+Tregs比例比較 與治療前相比，治療后兩組患兒外周血中CD4+CD25+Tregs百分比均有所升高，且觀察組比對照組升高的程度更大(P<0.05)。見表5。

表4血清IL-5和IFN-γ治療前后水平比較

項目例數(shù)IL-5(pmol/L)INF-γ(ng/L)治療前治療后治療前治療后對照組47307.49±87.60182.82±37.4815.43±1.7717.73±1.87觀察組47305.69±91.82162.33±38.5515.38±1.8219.05±1.97t值0.0972.6130.1353.332P值>0.05<0.05>0.05<0.05

表5外周血中CD4+CD25+Tregs比例治療前后比較

項目例數(shù)CD4+CD25+Tregs治療前治療后t值P值對照組479.49±2.3713.07±2.157.670<0.05觀察組479.59±2.2914.09±1.9710.213<0.05t值0.2082.398P值>0.05<0.05

3 討論

支氣管哮喘這一炎性疾病的發(fā)生主要是由于炎癥介質(zhì)、細胞因子等物質(zhì)對呼吸道刺激造成的，其支氣管主要表現(xiàn)為氣道重塑或支氣管痙攣等，對患者的工作生活造成嚴重影響[5]。支氣管哮喘的反復(fù)發(fā)作，氣道發(fā)生纖維化和重塑，其主要原因是氣道受到一些炎癥介質(zhì)如白三烯等的反復(fù)刺激。從分子生物學(xué)角度考慮，免疫紊亂可能是造成該疾病的重要原因[6-7]。相關(guān)研究[6]表明，引起哮喘疾病的內(nèi)在機制可能是以輔助型T細胞2(Th2)為主的輔助型T細胞1(Th1)/Th2失衡、IFN-γ水平下降以及IL-5因子增多等。為解決當(dāng)前常用藥物不能根治哮喘的局面，研究人員不斷探索如何使Th1/Th2的平衡保持穩(wěn)定以及減少合成白三烯(LTs)，這可能為哮喘的治療提供新方法。

CD4+CD25+Tregs于1995年被發(fā)現(xiàn)具有免疫抑制和免疫無能性的特征，主要作用機制是對機體的免疫平衡進行調(diào)節(jié)，這種細胞是一種抑制免疫調(diào)節(jié)的細胞是(由Sakaguchi等首次發(fā)現(xiàn))。國內(nèi)外研究[8-11]表明，在支氣管哮喘的控制中，CD4+CD25+Tregs對其他免疫細胞活性的調(diào)節(jié)具有重要意義。CD4+CD25+Tregs可以對T細胞的增殖分化起到抑制作用，主要機制為這類細胞的表達產(chǎn)物作用于B7細胞后可以釋放抑制因子作用于T細胞。同時其分泌的多種細胞因子具有抑制作用，具體如轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、IL-10、IL-4等[12]，然而對于其作用的發(fā)揮是否是通過可溶性細胞因子來實現(xiàn)的，現(xiàn)今尚無明確說法。有研究[13]證實，支氣管哮喘患兒急性發(fā)作期間體內(nèi)CD4+CD25+Tregs的表達水平與患兒肺部的變化程度呈反比；同時其他研究[14]表示，哮喘的發(fā)生可能與CD4+CD25+Tregs的減少有關(guān)。本研究結(jié)果類似于其他研究[11-12]結(jié)論，即處于急性期的哮喘患兒外周血中CD4+CD25+Tregs水平明顯增高，這表明造成支氣管哮喘的原因可能為患兒免疫力的下降，這主要是由于其體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞的免疫功能失衡所致。

Th2作用于肺功能的機制為：分泌多種白細胞介素IL-13、IL-5、IL-4等活化嗜酸性粒細胞，從而導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性、肺部炎癥、黏液分泌等，甚至造成氣道重塑等嚴重反應(yīng)[14]。IFN-γ抑制炎癥反應(yīng)的機制為：調(diào)節(jié)炎癥細胞，如Th17、B細胞、嗜酸粒細胞等的反應(yīng)性，從而對其他炎癥介質(zhì)引起的過敏性炎癥與氣道高反應(yīng)性起到抑制作用[15]。在Th1/Th2的平衡中，IL-5與IFN-γ的拮抗起到關(guān)鍵作用，本文通過研究證實了上述觀點。

當(dāng)前臨床治療急性支氣管哮喘常用藥物為吸入性糖皮質(zhì)激素，具有較強的與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合能力[16]，能夠顯著改善臨床癥狀，然而并不能根治哮喘，這是由于激素不能阻止LTs的合成及其對呼吸道的作用，因而患者病情反復(fù)。與激素治療相比，孟魯司特這一新型藥物的作用機制是選擇性與患兒體內(nèi)支氣管平滑肌的白三烯受體相結(jié)合，且該藥還具有依從性好、口感好等優(yōu)點[17-19]。本研究結(jié)果顯示，觀察組患兒肺功能各項指標(biāo)改善明顯優(yōu)于對照組，且日間夜間癥狀評分顯著低于對照組(P<0.05)。證實孟魯司特治療兒童支氣管哮喘急性發(fā)作期效果顯著，不僅能夠顯著改善喘息等臨床癥狀，還能提高其肺功能。同時，研究結(jié)果還顯示，觀察組患兒IFN-γ與IL-5水平變化等方面效果均優(yōu)于對照組(P<0.05)，其原因主要為該藥阻斷了白三烯受體。這一結(jié)果表明孟魯司特可以提高患者CD4+CD25+Tregs水平，從根本上治療炎癥。

綜上所述，孟魯司特通過選擇性阻斷LTs從而消除炎癥反應(yīng)，調(diào)高CD4+CD25+Tregs的比例，以及調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡，抑制T細胞的活性，從而有效的改善肺部功能，達到控制哮喘炎癥的目的，因此，該項目藥物可以廣泛的應(yīng)用于臨床。