苗懋東，倪珺，石鳳垚，李文慧，蔡云棟，芮榮

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

在雌性動(dòng)物發(fā)情周期，卵母細(xì)胞隨卵泡發(fā)育產(chǎn)生相應(yīng)變化，只有卵泡內(nèi)激素和其他細(xì)胞因子達(dá)到合適水平，卵母細(xì)胞才能重新獲得成熟分裂的能力進(jìn)而發(fā)育成熟，其中雌激素的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(GPER)是一種通過(guò)磷脂酰肌醇激酶(PI3K)作用的細(xì)胞內(nèi)跨膜雌激素結(jié)合受體[1]。已有GPER在小鼠發(fā)情周期的卵巢分布和表達(dá)的相關(guān)報(bào)道，證實(shí)其分布和表達(dá)量變化與卵泡發(fā)育過(guò)程及發(fā)情周期中雌激素的變化規(guī)律基本一致[2]。在山羊卵巢的研究中，GPER廣泛分布于發(fā)情周期中奶山羊各級(jí)卵泡，并不同程度地參與了卵泡成熟[3]。此外，也有研究表明GPER在小鼠下丘腦和豬垂體等部位均有表達(dá)，提示其可能參與了動(dòng)物發(fā)情周期和腺垂體內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)[4-5]；但迄今未見GPER在豬卵泡中表達(dá)與作用的報(bào)道。本試驗(yàn)旨在研究GPER在豬不同大小卵泡卵母細(xì)胞的分布與表達(dá)，以期為后續(xù)試驗(yàn)和相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 豬不同大小卵泡COC與卵泡壁的采集

從南京元潤(rùn)食品有限公司下屬屠宰場(chǎng)采集豬卵巢，置于37 ℃含1 000 U/mL青、鏈霉素?zé)o菌生理鹽水中，2 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。將卵巢放入玻璃表面皿中，實(shí)體顯微鏡下分別剝離直徑小于3 mm、3～5 mm及大于5 mm健康完整有腔卵泡，用無(wú)菌眼科剪與眼科鑷撕開卵泡壁釋放卵泡液及COC，輕刮卵泡內(nèi)壁確保COC從卵泡壁分離。將各組卵泡壁保存于液氮中用于GPER蛋白表達(dá)分析；各組卵泡COC于無(wú)血清TCM 199培養(yǎng)液(GIBCO)洗2次后用作免疫熒光染色；另取部分母豬卵巢組織浸入4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行固定，以備免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

卵巢組織經(jīng)過(guò)4%多聚甲醛固定后，按照表面卵泡直徑小于3 mm、3～5 mm及大于5 mm的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修塊處理，取1 cm3大小組織塊重新固定12 h后制作蠟塊備用；常規(guī)組織切片，卵巢組織切為4 μm厚的連續(xù)切片，將切片脫蠟處理、水化、PBS洗滌、滅活，用0.01 mol/L檸檬酸鹽抗原修復(fù)液對(duì)切片進(jìn)行抗原熱修復(fù)；接下來(lái)封閉、孵育一抗及二抗、DAB顯色1 min，蒸餾水終止反應(yīng)；切片置于蘇木素染色缸中復(fù)染后脫色，然后梯度脫水，最后滴加中性樹膠封片。封好的切片置于顯微鏡下，選取含不同大小卵泡的視野進(jìn)行觀察、拍照并進(jìn)行圖像分析。

1.3 蛋白免疫印跡

把收集到的卵泡壁分別剪碎，按照每20 μg組織添加200 μL裂解液的比例加入含1 μmol/L PMSF的RIPA裂解液，用超聲破碎儀勻漿直至充分裂解后12 000 r/min離心10 min取上清；按照BCA蛋白定量試劑盒(康為世紀(jì))說(shuō)明書依次進(jìn)行蛋白定量；在保證上樣蛋白含量一致的前提下分別加入不同體積的5×loading buffer，吹打混勻后放在100 ℃沸水中煮10 min使蛋白變性。采用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離樣品總蛋白；經(jīng)電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上后封閉。孵育抗體目的蛋白為兔源GPER多克隆抗體(Novus)、內(nèi)參蛋白為兔α-tubulin多克隆抗體(Abcam)，二抗為山羊抗兔IgG(H+L)-HRP(康為世紀(jì))。將孵育二抗后的PVDF膜洗凈置于TBST液中等待曝光顯影。按照ECL化學(xué)發(fā)光底物(Biosharp)說(shuō)明書1∶1配置工作液，使PVDF膜與其充分反應(yīng)30 s，置于凝膠成像系統(tǒng)(Fujifilm LAS-4000)中曝光顯色并拍照[6]。

1.4 間接免疫熒光染色與激光共聚焦顯微鏡觀察

各組卵泡COC分別用4%多聚甲醛室溫固定1 h后移入1% TritonX-100置于37 ℃濕盒中通透8～12 h，再用1%牛血清白蛋白(BSA)于37 ℃濕盒封閉1 h，之后取COC置于兔GPER多克隆抗體(1∶200)中在4 ℃濕盒避光孵育12 h，后用Alexa Fluor 488標(biāo)記驢抗兔IgG(1∶1 000)室溫避光孵育1 h；最后用0.01 g/L Hoechst 33342避光染核，于37 ℃濕盒孵育10 min后洗凈封片。用激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM700 META, Oberkochen, Germany)觀察封片后的細(xì)胞并拍照保存，分析GPER在豬不同大小卵泡COC的分布與表達(dá)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)至少設(shè)置3次重復(fù)。利用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行免疫組化染色強(qiáng)度的平均光密度分析，Western blot結(jié)果通過(guò)Image J軟件分析目的蛋白與內(nèi)參蛋白表達(dá)強(qiáng)度的比率來(lái)統(tǒng)計(jì)豬不同大小卵泡中GPER蛋白表達(dá)水平。數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件One-Way ANOVA LSD，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SE)表示，采用Duncan’s檢驗(yàn)法檢測(cè)不同組之間的差異顯著性，P<0.05判為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同大小豬卵泡GPER的分布

GPER是一種膜受體，GPER陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞核不著色的空泡狀，細(xì)胞質(zhì)著色較淺而胞膜著色較深。GPER免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物呈黃棕色分布于豬不同發(fā)育階段的卵泡中，不同大小卵泡的卵泡壁層顆粒細(xì)胞，卵泡膜細(xì)胞均有分布(圖1A、B、C)。其中以大于5 mm卵泡的顆粒細(xì)胞分布最多、著色最深，其陽(yáng)性物質(zhì)著色于細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)，胞核不著色；卵泡膜細(xì)胞呈現(xiàn)扁平的卵圓形，較顆粒細(xì)胞著色稍淺；卵巢間質(zhì)中有極弱的GPER表達(dá)(圖1C)。

A. 直徑小于3 mm卵泡；B. 直徑3～5 mm卵泡；C. 直徑大于5 mm卵泡；D. 陰性對(duì)照

圖1 豬不同大小卵泡中GPER的分布(200×)

2.2 不同大小豬卵泡免疫組化染色的平均光密度變化

豬不同大小卵泡免疫組化染色的平均光密度變化如圖2所示。從圖中可以看出，GPER平均光密度值與卵泡直徑呈正相關(guān)，直徑3～5 mm卵泡GPER平均光密度值顯著高于直徑小于3 mm卵泡(P<0.05)；直徑大于5 mm卵泡GPER平均光密度值極顯高于直徑小于3 mm卵泡(P<0.01)。說(shuō)明GPER的表達(dá)量隨著卵泡發(fā)育呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，卵泡直徑越大，GPER表達(dá)量越高。

2.3 不同大小豬卵泡GPER蛋白的表達(dá)

從圖3可以看出，與直徑小于3 mm卵泡相比，直徑3～5 mm卵泡和大于5 mm卵泡GPER蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；豬卵泡直徑越大，對(duì)應(yīng)的GPER蛋白相對(duì)表達(dá)量越高。大于5 mm豬卵泡中GPER蛋白表達(dá)量最高，極顯著高于小于3 mm卵泡和3～5 mm卵泡(P<0.01)。

* P<0.05，** P<0.01。下同

圖2 豬不同大小卵泡免疫組化染色的平均光密度變化

圖3 豬不同大小卵泡中GPER蛋白的表達(dá)

2.4 豬卵泡COC的眼觀形態(tài)特征

分別從直徑小于3 mm、3～5 mm及大于5 mm卵泡液中采集COC。實(shí)體顯微鏡下可見卵母細(xì)胞均為圓形，周圍有帶狀物，透明帶外層包裹數(shù)層卵丘細(xì)胞。小于3 mm卵泡COC卵母細(xì)胞包被1-2層卵丘細(xì)胞(圖4A、4a)；3～5 mm卵泡COC卵母細(xì)胞包被3-4層卵丘細(xì)胞(圖4B、4b)；大于5 mm卵泡COC具有完整的卵丘結(jié)構(gòu)(圖4C、4c)。

A和a. 直徑小于3 mm卵泡COC；B和b. 直徑3～5 mm卵泡COC；C和c. 直徑大于5 mm卵泡COC；A、B、C(100×);a、b、c(400×)

圖4 豬不同大小卵泡COC眼觀形態(tài)特征

2.5 豬卵泡中GPER的定位

各組卵泡COC GPER的定位與表達(dá)如圖5A所示，不同大小卵泡COC其卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞都有GPER表達(dá)，GPER主要分布在卵丘細(xì)胞膜上，在卵母細(xì)胞中呈現(xiàn)全細(xì)胞著色但著色較淺。應(yīng)用ImageJ對(duì)GPER熒光圖片進(jìn)行半定量分析發(fā)現(xiàn)，GPER在直徑3～5 mm卵泡COC表達(dá)量最高，顯著高于直徑大于5 mm卵泡COC(P<0.05)(圖5B)。

A. GPER和DNA在豬卵泡COC的定位，標(biāo)尺為50 μm；B. 半定量分析GPER表達(dá)

圖5 GPER在豬不同大小卵泡COC的定位

3 討論

在雌性動(dòng)物生殖周期中，隨著卵泡發(fā)育、成熟，雌激素分泌增加。合成的雌激素不僅參與調(diào)控動(dòng)物的發(fā)情與排卵，也參與調(diào)控卵母細(xì)胞成熟和卵丘細(xì)胞擴(kuò)散。雌激素通過(guò)其核受體ERα和ERβ參與和調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物卵巢的生理功能已被廣泛證實(shí)，近年研究表明雌激素還可以通過(guò)GPER快速介導(dǎo)的非基因組途徑影響生殖系統(tǒng)的功能[1]。

WANG等[7]通過(guò)免疫熒光對(duì)倉(cāng)鼠卵巢進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)GPER分布于卵泡顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞、黃體細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞、卵母細(xì)胞等處。耿陽(yáng)雪等[2]和王文麗等[3]應(yīng)用免疫組化分別在小鼠和山羊上也取得了類似的研究結(jié)果。本試驗(yàn)通過(guò)免疫組化和免疫熒光染色對(duì)豬不同大小卵泡卵母細(xì)胞上GPER的分布進(jìn)行探究，結(jié)果表明豬不同大小卵泡的卵泡壁層顆粒細(xì)胞，卵泡膜細(xì)胞、卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞均有GPER分布，其中以>5 mm卵泡的顆粒細(xì)胞分布最多、著色最深。卵巢間質(zhì)中有極弱的GPER表達(dá)。GPER在體細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞主要定位在質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上[8-10]。本試驗(yàn)中，GPER陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞核不著色的空泡狀，細(xì)胞質(zhì)著色較淺而胞膜著色較深，廣泛存在于豬不同大小卵泡顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞和COC上?；葭x[11]在山羊卵巢研究中也得到類似的結(jié)果。另有研究發(fā)現(xiàn)，GPER在小鼠卵母細(xì)胞成熟分裂各時(shí)期，細(xì)胞膜表面的熒光信號(hào)明顯[12]，針對(duì)斑馬魚、美國(guó)石首魚和金魚的研究結(jié)果也驗(yàn)證了這一現(xiàn)象[13-14]，不同的是，美國(guó)石首魚和斑馬魚的卵泡細(xì)胞中不存在GPER的表達(dá)。這些研究結(jié)果表明GPER在哺乳動(dòng)物卵泡的分布與表達(dá)具有一定的保守性。

進(jìn)一步研究豬不同大小卵泡中GPER的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)量隨卵泡發(fā)育呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，卵泡直徑越大，GPER表達(dá)量越高。這與惠琦輝[11]在山羊不同發(fā)育階段卵泡中GPER相對(duì)表達(dá)量的研究結(jié)果相似。GPER這一具有發(fā)育階段依賴性的表達(dá)特點(diǎn)提示其可能與卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟作用有關(guān)，但仍需今后試驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明，GPER在豬卵泡中的分布與表達(dá)和卵泡發(fā)育有密切關(guān)系，不同大小豬卵泡的顆粒細(xì)胞、膜細(xì)胞、卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞均有GPER表達(dá)，其表達(dá)量隨卵泡發(fā)育逐漸上升，這可能與GPER參與調(diào)節(jié)了豬卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟有關(guān)。