顧曉曉，鄔琴，陶喬孝慈 ，馬雪，李劼，韓猛立，周 霞*，黃新，吳桐忠，張星星，鐘發(fā)剛

(1. 新疆農(nóng)墾科學院省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室，新疆 石河子 832000；2. 石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832003

大腸桿菌是一種具有重要公共衛(wèi)生意義的人畜共患病病原[1]，可分為腸道內(nèi)和腸道外致病性大腸桿菌。腸道內(nèi)大腸桿菌常引起腸道感染和病變，導(dǎo)致食欲不振、吸收功能障礙、排便失常等；腸道外致病性大腸桿菌則可引起多種動物腸道以外的多個臟器的病變，如腦炎、尿道炎、敗血癥等。獸醫(yī)臨床常見有犢牛腦炎、肺炎等[2]。

細菌產(chǎn)生耐藥性除了與攜帶眾多的耐藥基因有關(guān)外，生物被膜(biofilm, BF)是細菌產(chǎn)生耐藥性的另外一個重要原因。細菌依靠靜電力以特異或非特異性方式黏附到細胞間和支撐物表面，與各類代謝產(chǎn)物結(jié)合形成大量不易溶解的細胞外聚合物(EPS)，可抑制吞噬細胞和補體系統(tǒng)的激活作用，抵抗宿主免疫系統(tǒng)。因此，BF的產(chǎn)生能大大增強細菌的致病性以及耐藥性[3-6]。研究發(fā)現(xiàn)，不同來源的大腸桿菌能不同程度地形成BF[7]。

近年來，隨著新疆養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，由大腸桿菌引發(fā)的犢牛腦炎時有發(fā)生，給畜牧業(yè)造成一定的損失。實驗室從發(fā)生腦炎的犢牛大腦中分離鑒定了1株大腸桿菌，但對該菌株產(chǎn)生BF的能力及其影響因素未進行研究。本試驗在前期研究基礎(chǔ)上，采用細菌培養(yǎng)結(jié)合結(jié)晶紫染色法分析分離株產(chǎn)生BF的能力以及不同培養(yǎng)條件對BF產(chǎn)生的影響，為研究該病原形成BF的理論體系提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

石河子大學動物科技學院預(yù)防獸醫(yī)學實驗室從發(fā)生腦炎的犢牛大腦中分離鑒定，經(jīng)測序比對與大腸桿菌標準菌株CP054227.1相似度達99.72%；產(chǎn)BF能力較強的禽致病性大腸桿菌，由石河子大學動物科技學院預(yù)防獸醫(yī)實驗室鑒定保存。

1.2 主要試劑與儀器

LB、BHI、TSB培養(yǎng)基、96孔細胞培養(yǎng)板和結(jié)晶紫染液等相關(guān)試劑，均購自廣州東盛生物科技有限公司；常規(guī)的儀器均由石河子大學動物科技學院預(yù)防獸醫(yī)實驗室提供。

1.3 分離株BF形成能力的測定

取40 μL菌液加入裝有160 μL LB培養(yǎng)基的96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后用PBS反復(fù)沖洗，加入結(jié)晶紫染液染色，用純化水洗滌后放入烘箱中烘干，將96孔細胞培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。后再加入乙醇-丙酮(4∶1的比例)于96孔板進行脫色，酶標儀檢測OD595值，取3個平行樣，記錄平均值，采用GraphPad prism軟件進行單因素方差分析，利用實驗室分離到的一株形成BF能力較強的禽致病性大腸桿菌作為對照組與分離株作比較。

BF形成能力的鑒定標準參照文獻[8]。依據(jù)臨界(ODC)值(ODC等于空白對照孔的平均值加上其3倍的標準差)，BF形成能力可分類為：OD≤ODC為不形成生物被膜，ODC4ODC為強生物被膜形成。

1.4 培養(yǎng)時間對分離株BF形成的影響

設(shè)定不同的培養(yǎng)時間(6、12、24、36、48及72 h)，培養(yǎng)結(jié)束后，用1.3的方法進行形態(tài)學觀察以及OD595值的測定。

1.5 不同成分對分離株BF形成能力的影響

取適量菌液，加入含有不同濃度葡萄糖(1%、2%、3%、5%)、不同濃度的蔗糖(1%、2%、3%、5%)、不同濃度NaCl(0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%)的液體培養(yǎng)基，用1.3的培養(yǎng)方式培養(yǎng)至BF形成的最佳時間進行形態(tài)學的觀察以及OD值的測定。

1.6 不同培養(yǎng)基對分離株BF形成的影響

按1.3的培養(yǎng)方式取適量菌液加入相應(yīng)液體培養(yǎng)基(LB、BHI、TSB)，在培養(yǎng)的最佳時間進行BF形態(tài)學的觀察以及OD值的測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株BF形成能力的測定

禽源大腸桿菌可見菌體呈現(xiàn)散落的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有形成緊密的相對完整BF結(jié)構(gòu)(圖1A)；分離株在24 h可見形成間斷的細線狀的BF，結(jié)構(gòu)較為松散，無明顯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖1B)；分離株OD值在ODC

2.2 分離株形成BF最佳時間的測定

6 h時開始有BF形成但形成量較少，初步形成呈零星的點狀的BF；6～24 h的OD值逐漸升高，12 h時可見零星短線狀的BF；24～36 h的OD值仍處于上升趨勢，但上升幅度不大，24 h形成間斷的細線狀的BF較為松散，36 h形成稍粗線狀的BF和較多的短桿狀的結(jié)構(gòu)；36～48 h的OD值趨于平穩(wěn)，BF的形成量已到達頂峰，48 h形成了連續(xù)的線條狀的BF且點狀結(jié)構(gòu)較為密集；48 h以后OD值迅速下降，形態(tài)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為松散不緊密。結(jié)果顯示分離株形成BF的最佳時間為48 h，見圖2。

圖1 禽致病性大腸桿菌(A)與致犢牛腦炎大腸桿菌(B)培養(yǎng)24 h的形態(tài)(400×)

圖2 致犢牛腦炎大腸桿菌BF在不同培養(yǎng)時間內(nèi)OD595值的測定

2.3 不同成分對分離株BF形成的影響

(1)不同濃度葡萄糖對BF的影響

隨著葡萄糖濃度的升高，BF的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸完整，OD595值逐漸升高；當葡萄糖濃度達到3% 時BF形態(tài)最為完整，OD595值最大，極顯著高于其他3組(P<0.001)，其余三組間無顯著性差異(P>0.05)；隨著糖濃度的繼續(xù)升高BF結(jié)構(gòu)逐漸松散，且OD595呈下降趨勢，見圖3。

圖3 致犢牛腦炎大腸桿菌BF在不同濃度葡萄糖培養(yǎng)基中OD595值的測定

(2)不同濃度蔗糖對分離株BF形成的影響

隨著蔗糖濃度的升高BF的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸完整。當濃度達到1%時，BF的形態(tài)最佳，OD595最大,極顯著高于其他3組(P<0.001)，其余三組間無顯著性差異(P>0.05)；隨著蔗糖濃度的繼續(xù)增加，BF結(jié)構(gòu)逐漸松散，且OD595呈下降趨勢，見圖4。

圖4 致犢牛腦炎大腸桿菌BF在不同濃度蔗糖培養(yǎng)基中OD595值的測定

(3)不同濃度NaCl對分離株BF形成的影響

隨著NaCl濃度的升高，BF的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸松散。當濃度達到0.5%時，BF形態(tài)最為完整,極顯著高于0%和0.5%組(P<0.001)，1%組顯著高于1.5%和2%組(P<0.05)。隨著NaCl濃度繼續(xù)增加，BF的形態(tài)逐漸松散，此時OD595呈下降趨勢，見圖5。

圖5 致犢牛腦炎大腸桿菌BF在不同濃度NaCl中OD595值的測定

2.4 分離株BF在不同培養(yǎng)基中的測定

48 h時，分離株BF在LB培養(yǎng)基中OD595值最大，顯著高于其他兩種培養(yǎng)基(P<0.05)，形態(tài)最為完整；在BHI培養(yǎng)基中BF形成的OD值最小，最為松散；TSB培養(yǎng)基中測得的OD值趨于二者之間，見圖6。

圖6 致犢牛腦炎大腸桿菌BF在不同培養(yǎng)基中OD595值的測定

3 討論

BF是一種在自然條件下生長在物體表面的細菌形成的自我保護狀態(tài)，可以使細菌的耐藥性增加，且能很好抵抗氧化應(yīng)激、脫水和饑餓等不良因素而間接增強細菌的毒力[9]。生物膜形成涉及四個主要步驟：初始粘附或附著(可逆)；生物膜結(jié)構(gòu)的早期形成(不可逆轉(zhuǎn))；已形成的生物膜成熟和細菌從生物膜中分散以恢復(fù)浮游狀態(tài)[10-11]。成熟的生物被膜結(jié)構(gòu)由外到內(nèi)依次是主體生物被膜層、連接層、條件層和基質(zhì)層[12-13]。一旦細菌開始分泌細胞外多糖物質(zhì)(EPS)，就會進入生物膜的第二階段發(fā)展，這是一個不可逆轉(zhuǎn)的過程。EPS的分泌是連續(xù)的，直到形成第三階段，確保細菌在厚的復(fù)雜生物分子層內(nèi)的表面安全附著。生物膜通過吞噬細胞和補體系統(tǒng)的受損激活保護入侵細菌免受宿主免疫系統(tǒng)的影響，并且還使其對常規(guī)抗生素的抗性增加約1 000倍。BF的形狀、緊密度和厚度根據(jù)細菌類型和環(huán)境條件而變化[14]。研究表明不同來源大腸桿菌產(chǎn)生BF的能力不同，很多分離株體外培養(yǎng)大腸桿菌在24-32 h時即能形成穩(wěn)定的BF[15]。與本實驗室分離保存的禽致病性大腸桿菌相比在相同的培養(yǎng)條件下，本試驗菌株BF形成能力較弱，即BF形態(tài)較為松散，BF網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不完整，當培養(yǎng)時間在36-48 h時才形成形態(tài)相對完整的BF。而前期研究表明本試驗菌株能引起犢牛腦炎，動物感染試驗也表明其具有較強致病性。因此與致病性相關(guān)的其他主要因素還需進一步研究。

研究表明，營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)的突然變化可以誘導(dǎo)生物膜擴散。在銅綠假單胞菌的試驗中，由于碳底物可用性的突然降低和突然增加，發(fā)現(xiàn)在基本培養(yǎng)基中生物膜產(chǎn)生分散[16]。當營養(yǎng)物質(zhì)稀缺時，細胞可能脫離以逃避不利條件，或者當營養(yǎng)充足時，可選擇將代謝能量投入生殖和分離。在熒光假單胞菌中，饑餓誘導(dǎo)了外多糖裂解酶產(chǎn)生和生物膜分散的增加，而在銅綠假單胞菌中，藻酸鹽裂解酶活性在快速生長的細胞中被最大程度地誘導(dǎo)[17]。同樣，這兩個結(jié)果表明，在有利和不利條件下都可能出現(xiàn)增加生物膜擴散速率。在非假單胞菌中，營養(yǎng)缺乏導(dǎo)致增加水生嗜水氣單胞菌中的生物膜分散，而高營養(yǎng)條件誘導(dǎo)生物膜在環(huán)境不動桿菌中擴散[18]。在大腸桿菌中，外源葡萄糖阻斷了CsrA誘導(dǎo)的生物膜分散，CsrA是中心碳通量的全球調(diào)節(jié)劑，進一步支持營養(yǎng)條件可誘導(dǎo)生物膜擴散的假設(shè)[19]。陶健等[20]在M63培養(yǎng)基中添加3%葡萄糖培養(yǎng)大腸桿菌72 h時形成BF的量最高。本試驗中分離株在LB培養(yǎng)基中添加3%的葡萄糖有利于大腸桿菌BF的形成，而糖濃度繼續(xù)增高不利于分離株BF的產(chǎn)生。關(guān)于葡萄糖對BF形成的影響有著不同的報道，KRISTICH等[21]報告了增加葡萄糖濃度會產(chǎn)生抑制作用，而BALDASSARRI等[6]則報道了在0.5%葡萄糖下形成了完整的生物膜，PILLAI等[22]報道了濃度<1%時是增強作用，0.5%是最適濃度。適當濃度NaCl可以促進BF的形成[23-24]，但隨含量的升高均表現(xiàn)出BF的形成受抑制現(xiàn)象。本研究結(jié)果也證實了這點。LB、BHI、TSB三種培養(yǎng)基相較而言，BHI和TSB培養(yǎng)基比LB培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分豐富，而LB中BF形成最佳，因此營養(yǎng)物質(zhì)的相對匱乏有利于BF的形成。