膽固醇在血管平滑肌細(xì)胞的大量蓄積及其引發(fā)的炎癥、凋亡、細(xì)胞因子的釋放等是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)產(chǎn)生的重要機(jī)制，因此，抑制或減少膽固醇的蓄積可以減少AS的發(fā)生。研究表明，小凹是膽固醇流出的主要通道，平滑肌細(xì)胞中膽固醇的流出可減緩平滑肌細(xì)胞向泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而減慢粥樣斑塊的形成。小凹蛋白為小凹的主要骨架結(jié)構(gòu)，是小凹發(fā)揮作用的靶點(diǎn)，在膽固醇代謝方面發(fā)揮主要作用[1-2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)均已發(fā)現(xiàn)羅格列酮具有明顯的抗炎、抗AS作用[3-4]。依折麥布是一種新型降脂藥物，其機(jī)制是選擇性抑制腸膽固醇吸收，從而起到抗AS的作用[5]。但羅格列酮及依折麥布是否通過(guò)上調(diào)小凹蛋白-1(Caveolin-1)在平滑肌源性泡沫細(xì)胞表達(dá)促進(jìn)膽固醇的外流，逆轉(zhuǎn)動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制尚不明確。本研究探討羅格列酮、依折麥布及兩者聯(lián)合對(duì)氧化修飾低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的平滑肌源性泡沫細(xì)胞Caveolin-1 mRNA表達(dá)的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 原代大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(VSMCs，齊氏細(xì)胞有限公司)，胎牛血清(上海Beyotime生物技術(shù)有限公司)，MEM/F12培養(yǎng)液、油紅O染液(武漢博士德生物公司)，ox-LDL(北京協(xié)生生物科技有限公司)，RNA提取試劑盒、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takala公司)，PCR引物及熒光定量PCR試劑盒(上海博士德生物公司)，胰蛋白酶(武漢Boster公司)，依折麥布(默沙東制藥公司饋贈(zèng))，瑞舒伐他汀(京新藥業(yè)公司)，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱型號(hào)3141(美國(guó) Thermo Fisher公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，Real-timePCR儀型號(hào)Quant Studio7(美國(guó) Applied Biosytems公司)。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 原代大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs中加入含15%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基， 3～5 d傳1代，取VSMCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 泡沫細(xì)胞模型的建立與鑒定 在平滑肌細(xì)胞中加入50 μg/mL的ox-LDL干預(yù)48 h后，采用油紅O染色法鑒定。用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗細(xì)胞3次去除死細(xì)胞后，用4%多聚甲醛固定30 min，再用油紅O染液染色后，于顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞泡沫化的情況。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組不進(jìn)行干預(yù)，僅單獨(dú)培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞48 h；泡沫細(xì)胞組用ox-LDL 50 μg/mL誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞，單獨(dú)培養(yǎng)48 h；依折麥布組先用ox-LDL 50 μg/mL干預(yù)平滑肌細(xì)胞48 h，建立泡沫細(xì)胞模型，后加入依折麥布3 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L繼續(xù)培養(yǎng)24 h；羅格列酮組先用ox-LDL 50 μg/mL干預(yù)平滑肌細(xì)胞48 h，建立泡沫細(xì)胞模型，后加入25 μmol/L羅格列酮繼續(xù)培養(yǎng)24 h；聯(lián)合組先用ox-LDL 50 μg/mL干預(yù)平滑肌細(xì)胞48 h，建立泡沫細(xì)胞模型，后加入依折麥布30 μmol/L和羅格列酮25 μmol/L繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每組分析3份樣本量。

1.2.4 用RT-PCR檢測(cè)各組中的Cavedin-1 mRNA表達(dá)水平

1.2.4.1 RNA的提取 細(xì)胞用PBS沖洗兩遍，加入1 mL Trizol，經(jīng)沉淀、洗滌后，溶解于DEPC水20 μL中，利用分光光度儀Nano Drop測(cè)定樣品RNA濃度及OD值。

1.2.4.2 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 采用SYBR預(yù)混的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，在Ep管中加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系2 μL 、Total RNA 1 μg及RNase Free dH2O使總體系為10 μL，將PCR儀反應(yīng)所得的cDNA置于-20 ℃下保存。

1.2.4.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng) Caveolin-1上游引物：5′-GAGCGAGAAGCAAGTGTACGA-3′，下游引物：5′-ACAGACGGTGTGGAACGTAGAT-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃預(yù)變性5 s，60 ℃退火20 s，共40個(gè)循環(huán)，各組PCR設(shè)3個(gè)副孔，以GAPDH為內(nèi)參，mRNA表達(dá)相對(duì)量用2-△△CT表示。

2 結(jié) 果

2.1 VSMCs形態(tài)學(xué)觀(guān)察 細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，有突起、細(xì)長(zhǎng)，局部區(qū)域重疊多層，呈“峰-谷”樣。

2.2 依折麥布單藥對(duì)Caveolin-1 mRNA表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，泡沫細(xì)胞組及依折麥布組Caveolin-1 mRNA表達(dá)量均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與泡沫細(xì)胞組比較，不同濃度依折麥布組Caveolin-1 mRNA表達(dá)量顯著增加，且呈一定濃度依賴(lài)性(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 不同濃度依折麥布對(duì)Caveolin-1 mRNA表達(dá)的影響(±s)

與空白對(duì)照組比較，①P<0.05；與泡沫細(xì)胞組比較， ②P<0.05；與依折麥布3 μmol/L組比較， ③P<0.05；與依折麥布10 μmol/L組比較， ④P<0.05。

2.3 依折麥布聯(lián)合羅格列酮對(duì)Caveolin-1 mRNA表達(dá)的影響 與空白對(duì)照組比較，泡沫細(xì)胞組Caveolin-1 mRNA表達(dá)量下降(P<0.05)；與泡沫細(xì)胞組比較，依折麥布30 μmol/L組、羅格列酮組及聯(lián)合組Caveolin-1 mRNA表達(dá)增加量，且聯(lián)合組與依折麥布30 μmol/L組和羅格列酮組比較，Caveolin-1 mRNA表達(dá)增加更為明顯。詳見(jiàn)表2。

表2 依折麥布聯(lián)合羅格列酮對(duì)Caveolin-1 mRNA表達(dá)的影響(±s)

與空白對(duì)照組比較，①P<0.05；與泡沫細(xì)胞組比較， ②P<0.05；與依折麥布30 μmol/L組比較， ③P<0.05；與羅格列酮組比較， ④P<0.05。

3 討 論

膽固醇的流出是指膽固醇從特定的通道由細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外進(jìn)行代謝，膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)可減少泡沫細(xì)胞的形成，從而減少脂質(zhì)斑塊的形成[6-7]。因此，減少細(xì)胞內(nèi)蓄積的膽固醇對(duì)臨床疾病治療意義重大。大量研究顯示，Caveolin-1在膽固醇的流出中發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)中心的關(guān)鍵作用。小凹是細(xì)胞外膽固醇流出主要通道，Caveolin-1是小凹的主要組成蛋白，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、維持細(xì)胞內(nèi)外的膽固醇平衡有重要的作用[1，8]。

羅格列酮是一種噻唑烷二酮類(lèi)抗糖尿病藥，通過(guò)提高胰島素的敏感性而有效地控制血糖，其藥理作用是通過(guò)過(guò)氧化物酶體增殖激活受體-γ(PPAR-γ)實(shí)現(xiàn)的[9-11]。PPAR-γ作為核受體超家族的一員，是一種脂質(zhì)激活轉(zhuǎn)錄因子，PPAR-γ可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中的Caveolin-1表達(dá)，以減緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，羅格列酮可提高脂化后細(xì)胞內(nèi)小凹蛋白的表達(dá)，說(shuō)明對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化病人，羅格列酮本身具有延緩粥樣斑塊形成的作用。

臨床研究表明，在他汀類(lèi)藥物治療基礎(chǔ)上進(jìn)一步服用依折麥布可降低血脂水平[13-14]。依折麥布為一種選擇性的膽固醇吸收抑制劑，可抑制小腸細(xì)胞刷狀緣的尼曼-匹克蛋白活性，從而降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，其分子量小，能反復(fù)進(jìn)行肝腸循環(huán)，主要抑制外源性的膽固醇以發(fā)揮降血脂的作用。研究發(fā)現(xiàn)，依折麥布通過(guò)激活平滑肌細(xì)胞表面的脂質(zhì)激活轉(zhuǎn)錄因子，如LXRα、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP-1)，上調(diào)Caveolin-1的表達(dá)，促進(jìn)膽固醇流出，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用[8]。本實(shí)驗(yàn)證明應(yīng)用依折麥布干預(yù)脂化后的細(xì)胞可增加小凹蛋白的產(chǎn)生。

目前在臨床上，依折麥布僅用于降低血清膽固醇，雖然副作用較他汀類(lèi)藥少，但仍不是降血脂的首選藥物，也并沒(méi)有作為抗動(dòng)脈粥樣硬化的常規(guī)用藥；而羅格列酮也只應(yīng)用于控制血糖。依折麥布及羅格列酮均可使細(xì)胞內(nèi)的膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，且兩種藥物聯(lián)合使用，增強(qiáng)了這種效用。這種作用關(guān)鍵點(diǎn)在于提高了細(xì)胞內(nèi)小凹蛋白的表達(dá)，也并不排除兩種藥物作用于其他新的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。這兩種藥物及聯(lián)合使用后的作用還處于體外實(shí)驗(yàn)階段，在臨床上應(yīng)用能否達(dá)到明顯的抗動(dòng)脈粥樣硬化結(jié)果仍需進(jìn)一步研究。