張益前，莊芝芝，沈猛，莊捷秋，蔡暉

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.腎內(nèi)科；2.兒童腎內(nèi)科）

高血壓是腦卒中、冠心病的危險(xiǎn)因素，也是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因之一，其確切發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。鈉-氯共同轉(zhuǎn)運(yùn)子（sodium chloride cotransporter，NCC）表達(dá)在腎臟遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞，負(fù)責(zé)重吸收5%～10%的過濾 鈉[1]。過度活躍的NCC功能被認(rèn)為是導(dǎo)致高血壓發(fā)展的因素之一。因此，研究腎小管NCC上游調(diào)控蛋白對高血壓的防治具有重要意義。Ran結(jié)合蛋白M （Ranbinding protein M，RanBPM）是一種核質(zhì)蛋白，涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞形態(tài)調(diào)節(jié)和受體激活細(xì)胞內(nèi)信號通路的調(diào)節(jié)[2]。研究表明，RanBPM可通過調(diào)節(jié)c-Raf穩(wěn)定性抑制ERK1/2的活化[3]。本課題組早期的研究表明，WNK4通過激活ERK1/2信號通路來抑制NCC，酵母雙雜交篩選工具和共免疫沉淀的預(yù)實(shí)驗(yàn)初步數(shù)據(jù)也顯示W(wǎng)NK4與RanBPM存在相互作用[4]。本研究探討RanBPM是否通過ERK1/2信號傳導(dǎo)通路調(diào)控腎小管NCC的蛋白表達(dá)以及對WNK4功能的影響，為高血壓的診治探索新的治療靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠遠(yuǎn)曲小管（mouse distal convoluted tubule，mDCT）細(xì)胞獲贈于芝加哥大學(xué)Robert S.Hoover教授實(shí)驗(yàn)室，HEK 293T細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。脂質(zhì)體2000、RNAiMax脂質(zhì)體購自美國Invitrogen公司；抗myc抗體、抗HA抗體等兔多克隆抗體來自美國Abcam公司；總NCC抗體購自美國PhosphoSolutions公司；t-ERK1/2、 p-ERK1/2、β-actin等多克隆兔抗為美國Cell Signal Tech-nology公司產(chǎn)品；其余試劑均為市售分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 mDCT和HEK 293T細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含5% FBS+1%青/鏈霉素的DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)液中，置于細(xì)胞培養(yǎng)孵育箱（37 ℃，5% CO2，飽和濕度）內(nèi)孵育[4]。根據(jù)試劑盒說明書利用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒myc-RanBPM，轉(zhuǎn)染48 h后，裂解細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)行Western blot。利用RNAiMax脂質(zhì)體將RanBPM siRNA反轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。

1.3 免疫共沉淀檢測RanBPM蛋白與WNK4蛋白是否存在直接相互作用 HEK 293T細(xì)胞分接種于3個 6 cm培養(yǎng)皿，分別共轉(zhuǎn)染HA-WNK4質(zhì)粒和myc-vector（質(zhì)?？蛰d體作為對照），或myc-RanBPM（149～729全長）質(zhì)粒，或myc-RanBPM（149～353功能區(qū)域）質(zhì)粒后，48 h后收集細(xì)胞裂解液。用一抗（RanBPM的抗myc抗體）孵育2 h，然后加入蛋白G/A分離磁珠，在4 ℃處進(jìn)一步混合和孵育。使用裂解液洗滌2次，PBS液洗滌1次后，珠子將用萊姆利緩沖液（Bio-Rad）洗凈。洗脫的蛋白質(zhì)將由SDS-PAGE分離，然后使用一抗（WNK4的抗HA抗體）進(jìn)行Western blot分析。剩余細(xì)胞裂解液使用一抗（RanBPM的抗myc抗體）進(jìn)行Western blot分析。具體步驟依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室既往常規(guī)方法進(jìn)行[4]。

1.4 RanBPM對ERK1/2信號傳導(dǎo)通路的影響 HEK 293T細(xì)胞接種于4個6 cm培養(yǎng)皿，分為PBS組和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）組，各組分別轉(zhuǎn)染myc的質(zhì)?？蛰d體或者myc-RanBPM。EGF組用0.3 ng/mL EGF預(yù)處理HEK 293T細(xì)胞15 min，刺激ERK1/2磷酸化水平，PBS組加入等量PBS液作為對照，在EGF刺激ERK1/2磷酸化前后Western blot檢測RanBPM蛋白、ERK信號通路蛋白。

1.5 RanBPM過表達(dá)對NCC蛋白含量和ERK1/2磷酸化水平的影響 含有內(nèi)源性NCC的小鼠mDCT細(xì)胞接種于4個6 cm培養(yǎng)皿，2盤轉(zhuǎn)染myc空白質(zhì)粒，2盤轉(zhuǎn)染myc-RanBPM質(zhì)粒。48 h后采集細(xì)胞裂解液，經(jīng)過SDS-PAGE電泳，利用相應(yīng)的抗體檢測總NCC、myc-RanBPM、磷酸化ERK1/2、總ERK1/2和β-actin的蛋白質(zhì)水平。

1.6 siRNA抑制RanBPM基因?qū)CC的蛋白表達(dá)及ERK1/2磷酸化水平的影響 小鼠mDCT細(xì)胞分離培養(yǎng)在4個60 mm培養(yǎng)皿中24 h，細(xì)胞豐度至30%～50%時，2盤對照組轉(zhuǎn)染20 μL空siRNA，另2盤轉(zhuǎn)染20 μL RanBPM siRNA（應(yīng)用siRNA基因下調(diào)RanBPM）。48 h后將換成含抗生素不含F(xiàn)BS的DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，收集細(xì)胞裂解液，經(jīng)過SDSPAGE電泳和Western blot分析，利用相應(yīng)的抗體檢測出總NCC、RanBPM、磷酸化ERK1/2、總ERK1/2和β-actin的蛋白質(zhì)水平。

1.7 RanBPM和WNK4通過ERK1/2磷酸化調(diào)控NCC表達(dá) 為驗(yàn)證WNK4是否通過與RanBPM的相互作用來調(diào)節(jié)NCC的。將含有內(nèi)源性NCC的小鼠mDCT細(xì)胞接種于3個6 cm培養(yǎng)皿，分別共轉(zhuǎn)染了myc-RanBPM質(zhì)粒（1 μg）和逐步遞增WNK4質(zhì)粒（0.5、1.0、3.0 μg）。 48 h后采集細(xì)胞裂解液，經(jīng)過SDS-PAGE電泳和Western blot分析，利用相應(yīng)的抗體檢測出總NCC、WNK4、myc-RanBPM、磷酸化ERK1/2、總ERK1/2和β-actin的蛋白質(zhì)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，用表示，2組間數(shù)據(jù)比較采用成組t檢驗(yàn)；多樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，組間比較采用單因素方差分析，若數(shù)據(jù)不具有方差齊性則采用DunnettT3檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫共沉淀檢測RanBPM蛋白與WNK4蛋白是否存在直接相互作用 RanBPM全長或者功能區(qū)域質(zhì)粒能夠與WNK4發(fā)生免疫共聚焦作用，而質(zhì)粒空載體不與WNK4發(fā)生共聚焦作用（見圖1），證實(shí)RanBPM與WNK4之間有蛋白直接相互作用，并具有特異性。

圖1 WNK4與RanBPM之間存在蛋白相互作用

2.2 RanBPM對ERK1/2信號傳導(dǎo)通路的影響 結(jié)果顯示，0.3 ng/mL EGF處理HEK 293T細(xì)胞15 min后，ERK1/2磷酸化水平明顯增加，然而，在HEK 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染RanBPM的情況下，ERK1/2磷酸化水平呈現(xiàn)減少現(xiàn)象，證實(shí)RanBPM是ERK1/2磷酸化信號傳導(dǎo)通路的抑制劑。見圖2。

圖2 RanBPM抑制EGF誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化

2.3 RanBPM過表達(dá)對NCC蛋白含量和ERK1/2磷酸化水平的影響 mDCT細(xì)胞轉(zhuǎn)染myc-RanBPM 48 h后，與對照組比，過表達(dá)RanBPM可以顯著抑制ERK1/2磷酸化（P＜0.01），并顯著增加NCC的蛋白表達(dá)（P＜0.01），見表1，提示RanBPM通過抑制ERK1/2信號通路增加NCC蛋白表達(dá)。

表1 RanBPM過表達(dá)對NCC蛋白及ERK1/2蛋白相對表達(dá)量的影響（n=4， ）

表1 RanBPM過表達(dá)對NCC蛋白及ERK1/2蛋白相對表達(dá)量的影響（n=4， ）

組別 RanBPM NCC p-ERK/t-ERK control組 0.003±0.001 1.000±0.1151.000±0.074 RanBPM 1.0 μg組 0.604±0.102 1.470±0.1050.275±0.041t11.800 3.851 12.180P＜0.001 0.008 ＜0.001

2.4 siRNA抑制RanBPM基因?qū)CC蛋白表達(dá)及ERK1/2磷酸化水平的影響 轉(zhuǎn)染RanBPM siRNA后，RanBPM蛋白表達(dá)顯著下降。與對照siRNA組相比，RanBPM siRNA轉(zhuǎn)染組ERK1/2磷酸化水平顯著增加（P＜0.01）。與對照siRNA組比較，NCC蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01），見表2。進(jìn)一步證實(shí)，RanBPM基因下調(diào)后增加了ERK1/2信號通路活性，并下調(diào)了NCC蛋白表達(dá)。

表2 RanBPM表達(dá)下調(diào)對NCC、ERK1/2蛋白相對表達(dá)量的影響（n=4， ）

表2 RanBPM表達(dá)下調(diào)對NCC、ERK1/2蛋白相對表達(dá)量的影響（n=4， ）

組別 RanBPM NCC p-ERK/t-ERK control組 1.100±0.106 1.000±0.223 1.000±0.194 RanBPM siRNA組 0.008±0.003 0.556±0.132 2.301±0.220t20.710 4.666 4.770P＜0.001 0.003 ＜0.001

2.5 RanBPM阻止了WNK4對ERK1/2磷酸化的刺激作用及對NCC的抑制作用 在同時轉(zhuǎn)染RanBPM質(zhì)粒的情況下，在小鼠mDCT細(xì)胞上轉(zhuǎn)染W(wǎng)NK4質(zhì)粒，與低劑量的WNK4比較（0.5 μg作為對照組），逐步增加WNK4的質(zhì)粒劑量，沒有進(jìn)一步改變ERK1/2磷酸化的水平，也沒有明顯抑制NCC的蛋白表達(dá)作用（P＞0.05），見表3。這一結(jié)果提示由于RanBPM對ERK信號通路有抑制作用，RanBPM阻止了WNK4對ERK1/2信號通路的影響和對NCC蛋白表達(dá)的抑制作用，進(jìn)一步說明RanBPM與WNK4蛋白相互作用在NCC調(diào)節(jié)中的重要性。

3 討論

高血壓是慢性腎臟病相關(guān)的最常見合并癥，并且是慢性腎臟病進(jìn)展和心血管疾病的最重要的但可以改變的危險(xiǎn)因素之一[6]。然而，在臨床實(shí)際工作中，慢性腎臟病患者通常難以真正實(shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)难獕嚎刂?，主要原因是腎小管鹽敏感性增加。例如NCC磷酸化級聯(lián)的過度激活會增加腎遠(yuǎn)端腎單位中鈉的重吸收，從而導(dǎo)致鹽敏感性高血壓[7]。因此，深入研究NCC上游調(diào)控蛋白對防治難治性高血壓具有重要臨床價(jià)值。

表3 RanBPM阻止了WNK4對ERK1/2磷酸化的刺激作用及對NCC的抑制作用（n=4， ）

表3 RanBPM阻止了WNK4對ERK1/2磷酸化的刺激作用及對NCC的抑制作用（n=4， ）

組別 WNK4/actin RanBPM/actin NCC/actin p-ERK/t-ERK WNK4 0.5 μg 1.000±0.122 1.000 1.000± 0.093 0.838±0.306 WNK4 1.0 μg 1.643±0.134 1.182±0.261 1.028±0.104 0.856±0.178 WNK4 3.0 μg 1.885±0.151 1.055±0.176 0.977±0.246 0.877±0.177F22.410 0.966 0.061 0.029P＜0.001 0.417 0.942 0.971

腎臟的NCC主要分布于遠(yuǎn)曲小管，是腎小管重吸收鈉離子的通道蛋白之一。NCC受到多種因素的廣泛調(diào)節(jié)，包括膳食鹽、激素（醛固酮、血管緊張素II和血管加壓素）以及多種激酶，如WNK-SPAK/OSR1信號通路和MAPK-ERK1/2信號通路[8-9]，也包括NCC上游調(diào)控蛋白WNK家族（屬于絲氨酸/色氨酸激酶）。臨床上部分患者出現(xiàn)WNK1和WNK4激酶的突變可導(dǎo)致II型假性醛固酮減少癥，具有高血壓、高鉀血癥和代謝性酸中毒的臨床特征[10]。相關(guān)機(jī)制研究也證實(shí)WNK激酶不但可以通過刺激SPAK/OSR1信號傳導(dǎo)通路來上調(diào)NCC的功能和蛋白表達(dá)水平[11-12]，還通過激活ERK1/2信號通路來抑制NCC[4]。

RanBPM為一個核質(zhì)蛋白，其功能仍不明確，但與多種細(xì)胞功能有關(guān)，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞形態(tài)的調(diào)控以及受體激活的細(xì)胞內(nèi)信號的調(diào)控[3，13-14]。ERK通路調(diào)節(jié)凋亡蛋白的水平和活性，與細(xì)胞存活和增殖密切相關(guān)有關(guān)[15]。ERK1/2通常作為Ras/Raf/MEK1/2/ERK1/2信號級聯(lián)的一部分，我們的前期研究表明，WNK4激酶可激活MAP-ERK1/2激酶信號通路[4，16]。WNK1通過MEK5激活ERK5[17]。同樣，WNK2也通過Raf/MEK1/2激活ERK1/2[18]。這些發(fā)現(xiàn)表明，WNK激酶可以被視為MAPK信令級聯(lián)的一部分，且位于后者的上游。最近的一項(xiàng)研究表明，RanBPM具有抑制ERK1/2活化的作用[3]。本研究通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，全長和功能性RanBPM與WNK4均存在相互作用，故我們推測RanBPM可能參與對WNKERK1/2信號通路的調(diào)控。

本研究通過在培養(yǎng)小鼠DCT細(xì)胞中過表達(dá)Ran-BPM蛋白，發(fā)現(xiàn)ERK1/2磷酸化水平明顯下降，同時增強(qiáng)NCC總蛋白的表達(dá)。應(yīng)用siRNA技術(shù)將RanBPM基因表達(dá)下調(diào)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)刺激了ERK1/2磷酸化，從而降低NCC蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在存在RanBPM的情況下，WNK4失去了刺激ERK磷酸化的能力，并且也不能抑制NCC的蛋白表達(dá)。上述結(jié)果表明RanBPM由于其對ERK信號傳導(dǎo)通路的抑制作用，可能阻止了WNK4調(diào)節(jié)ERK1/2信號通路所依賴的NCC調(diào)節(jié)作用，也證實(shí)了RanBPM與WNK4之間存在蛋白相互作用，共同參與腎小管NCC調(diào)節(jié)作用。