王烜，梁敏，2，管敏鑫

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江 溫州 325015）

Leber遺傳性視神經(jīng)病變（Leber’s hereditary optic neuropathy，LHON）是一種母系遺傳的視神經(jīng)疾病，由Leber于1871年首次描述了此病的臨床癥狀而冠名。此病常發(fā)于男性青少年，為急性或亞急性，可雙眼同時(shí)發(fā)生或相繼發(fā)生，視力下降但不伴有轉(zhuǎn)眼痛并且呈現(xiàn)出視盤周圍神經(jīng)纖維層腫脹和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失等病變[1-2]。LHON與線粒體損傷存在著密切的關(guān)系，線粒體DNA突變是其主要致病分子基礎(chǔ)。自1988年Wallance等發(fā)現(xiàn)第一個(gè)與LHON相關(guān)的突變位點(diǎn)m.11778G＞A以來[3]，相繼報(bào)道過60多個(gè)與LHON相關(guān)的突變位點(diǎn)，其中線粒體復(fù)合體I上的ND1、ND4和ND6亞基是LHON有關(guān)突變熱點(diǎn)區(qū)域，但對(duì)位于tRNA上突變位點(diǎn)的報(bào)道相對(duì)較 少[4]。本研究報(bào)道了3個(gè)具有典型LHON臨床特征的中國漢族家系，經(jīng)檢測不攜帶3個(gè)主要原發(fā)突變位點(diǎn)，但是攜帶tRNALeu(CUN)上的12308A＞G突變。m.12308A＞G突變可能會(huì)導(dǎo)致tRNALeu(CUN)的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定[5-6]，從而影響線粒體功能。本課題組對(duì)3個(gè)先證者家系中患者和攜帶者進(jìn)行了臨床和分子遺傳學(xué)評(píng)估，并進(jìn)行了線粒體基因全序分析，發(fā)現(xiàn)m.12308A＞G突變可能與LHON有關(guān)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 本課題組與河北邢臺(tái)眼科醫(yī)院合作，建立了LHON家系收集網(wǎng)絡(luò)，在河北范圍內(nèi)收集臨床上被診斷為LOHN的漢族患者295例，并收集了他們的外周血液和相應(yīng)的臨床資料，同時(shí)收集了316例漢族正常人血樣作為對(duì)照。本研究通過溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受檢者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 眼科臨床檢查：對(duì)先證者和家系其他成員進(jìn)行眼科臨床檢查，包括視力、視野、色覺、屈光度、眼壓、眼底、瞳孔對(duì)光反射、視覺誘發(fā)電位（visual evoked potential，VEP）等檢查。視力損害程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：正?！?.3；一級(jí)視力損傷（輕度）0.1～0.3；二級(jí)視力損傷（中度）0.05～0.1；三級(jí)視力損傷（重度）0.02～0.05；四級(jí)視力損傷（極重度）光感～0.02；五級(jí)視力損傷為無光感[7]。

1.2.2 線粒體基因組突變分析：從3個(gè)家系先證者和其他母系成員的外周靜脈中抽取3～5 mL外周靜脈血，通過試劑盒（杭州易思得生物科技有限公司，DR0301050）提取血中DNA并用24對(duì)正反向線粒體引物進(jìn)行DNA擴(kuò)增。為了確定線粒體基因組的變異位點(diǎn)，用上述方法對(duì)3個(gè)家系的先證者進(jìn)行線粒體全序擴(kuò)增，通過DNAstar軟件包中的SeqMan對(duì)24對(duì)正反向測序結(jié)果進(jìn)行拼接，導(dǎo)出拼接的測序結(jié)果為FASTA格式，再與修正的線粒體DNA劍橋標(biāo)準(zhǔn)序列（Cambridge reference sequence，rCRS，NC_012920.1）[8]進(jìn)行比對(duì)，查找突變位點(diǎn)。

1.2.3 線粒體單倍體型分析：根據(jù)24對(duì)正反向引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物得出線粒體全序，對(duì)3個(gè)先證者的線粒體DNA進(jìn)行單倍體型分析，并將其歸到不同的類型中[9]。

1.2.4 線粒體種系發(fā)生學(xué)分析：根據(jù)GenBank選取17種動(dòng)物的線粒體序列，包括人（Homo sapiens）、大猩猩（Gorilla gorilla）、長臂猴（Hylobates lar）、鼠（Musmusculus）、斑馬魚（Danio rerio）、環(huán)尾狐猴（Lemur catta）、獼猴（Macaca mulatta）、 地中海獼猴（Macaca sylvanus）、白額卷尾猴（Cebus albifrens）、蜂猴（Nycticebus coucang）、倭黑猩猩（Pan paniscus）、黑猩猩（Pan troglodytes）、阿 拉伯狒狒（Papio hamadryas）、蘇門答臘猩猩（Pongo abelii）、牛（Bos taurus）、紅毛猩猩（Pongo pygmaeus）、馬來跗猴（Tarsius bancanus）[10]，對(duì)線粒體上編碼tRNALeu(CUN)的基因序列進(jìn)行保守性比對(duì)，并計(jì)算第44位點(diǎn)的保守系數(shù)。

1.2.5 線粒體拷貝數(shù)分析：采用Roche熒光定量試劑盒，對(duì)先證者和正常對(duì)照進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用Graphpad Prism 7軟件對(duì)先證者和正常對(duì)照者的線粒體數(shù)目的百分比進(jìn)行繪圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 3個(gè)家系均來自邢臺(tái)，L23家系先證者為III-2，L157家系先證者為III-2，L362家系先證者為III-1?；颊叨际怯捎陔p眼視力同時(shí)漸進(jìn)性無痛性下降就診，且性別都為男性，發(fā)病年齡分別為13、14、11歲。對(duì)先證者進(jìn)行了視力、眼底、屈光度等檢查，診斷為LHON，視力損傷程度分別為輕度、中度、輕度，并伴有視盤色淡充血等癥狀，先證者的臨床資料見表1，家系圖見圖1。對(duì)3個(gè)家系的外顯率進(jìn)行了分析，分別為9.1%、28.5%、27.2%。

2.2 線粒體基因組分析 抽取靜脈血，提取DNA，通過PCR擴(kuò)增目的片段，進(jìn)行突變基因的分析，并與劍橋參考序列進(jìn)行比對(duì)。本研究對(duì)先證者進(jìn)行了3個(gè)主要原發(fā)位點(diǎn)的檢測，分別擴(kuò)增了其ND1、ND4和ND63個(gè)基因片段，對(duì)其是否含有原發(fā)位點(diǎn)m.3460G＞A、 m.11778G＞A和m.14484T＞C進(jìn)行了篩查，發(fā)現(xiàn)3個(gè)先證者均不含3個(gè)主要原發(fā)位點(diǎn)。隨后用24對(duì)正反向引物擴(kuò)增了先證者和其母系成員的線粒體全序列并對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)3個(gè)先證者都攜帶位于D-loop上的73A＞G、263A＞G突變，16S rRNA上的1811A＞G、2706A＞G突變，ND2上的4769A＞G突變，COX1上的7028C＞T突變，ATP6上的8860A＞G突變和tRNALeu上的12308A＞G突變，3個(gè)家系母系成員突變位點(diǎn)集合見表2。選取的3個(gè)健康對(duì)照者（c1、c2和c3）與3個(gè)患者家系中的先證者線粒體序列見圖2。

表1 3例家系先證者的臨床資料

圖1 L23、L157和L362家系圖

通過對(duì)人、牛、鼠和猩猩等的mtDNA種系發(fā)生學(xué)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)m.12308A＞G在3個(gè)先證者中高度保守，而316例正常對(duì)照中未發(fā)現(xiàn)12308A＞G突變位點(diǎn)。tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，12308A＞G突變位點(diǎn)位于tRNALeu(CUN)反密碼子莖和s環(huán)的交界處（通用位點(diǎn)44位，見圖3）。進(jìn)一步對(duì)17個(gè)物種的種系發(fā)生學(xué)進(jìn)行保守性分析發(fā)現(xiàn)，tRNALeu(CUN)的保守性系數(shù)為100%[11]，見圖4。

2.3 線粒體單倍體型分析 單倍體型是位于mtDNA某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNPs位點(diǎn)。由于mtDNA缺乏組蛋白的保護(hù)且長期處于高濃度的ROS環(huán)境下導(dǎo)致mtDNA較于核基因更易突變[12]。隨著這些變易位點(diǎn)的累積并以母系遺傳的方式傳遞給后代的過程中，逐漸形成了不同的單倍體型[13]。單倍體型以發(fā)現(xiàn)的先后對(duì)照字母的順序進(jìn)行命名（由A到Z）[7，14]， 中國人群中主要存在A、B、C、D、F、G、M和Z等單倍體型[15]。本研究中的3個(gè)家系均屬于H2單倍體型。

圖3 tRNALeu(CUN)二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖

2.4 線粒體拷貝數(shù)分析 為了探究m.12308A＞G突變是否影響了線粒體數(shù)量，我們選取了3個(gè)家系的先證者（mL23、mL157、mL362）進(jìn)行線粒體拷貝數(shù)的測定，同時(shí)選取3個(gè)無血緣關(guān)系的正常人（c1、c2、c3）做對(duì)照，引物序列見表3，測定結(jié)果見圖5，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，mL23、mL157和mL362組線粒體拷貝數(shù)分別為對(duì)照組的79%、57%和91%，其中mL23和mL157組中患者線粒體拷貝數(shù)相對(duì)于正常對(duì)照者明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明突變位點(diǎn)tRNALeu(CUN)12308A＞G可能造成線粒體損傷，從而導(dǎo)致線粒體數(shù)量下降[16]。

3 討論

m.11778G＞A是LHON亞洲人群中最常見的原發(fā)突變位點(diǎn)，線粒體復(fù)合體I的ND1、ND4和ND6亞基上的堿基突變是引起LHON的熱點(diǎn)區(qū)域，但是編碼tRNA的區(qū)域也是十分重要的。在以往的報(bào)道中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了tRNA上的某些位點(diǎn)會(huì)影響線粒體功能從而導(dǎo)致線粒體疾病，例如tRNAMet4435A＞G會(huì)提高高血壓的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[17]，而tRNAThr15927G＞A會(huì)提高LHON的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[18]。

本研究中3個(gè)家系都表現(xiàn)出典型的LHON發(fā)病特征，即發(fā)病者都為男性，發(fā)病年齡小，發(fā)病急，可雙眼同時(shí)發(fā)生或相繼發(fā)病。對(duì)先證者和其他母系成員線粒體全序進(jìn)行基因分析，發(fā)現(xiàn)3個(gè)家系均攜帶tRNALeu(CUN)12308A＞G突變，而316例正常對(duì)照人群樣本中未發(fā)現(xiàn)此突變位點(diǎn)，我們推測tRNALeu(CUN)12308A＞G可能與LHON發(fā)病有一定關(guān)系。

圖4 17個(gè)物種突變位點(diǎn)保守性分析

表2 3個(gè)家系先證者突變位點(diǎn)集合

續(xù)表2

圖5 線粒體拷貝數(shù)相對(duì)百分比比較

表3 線粒體拷貝數(shù)測定引物序列

本研究中3個(gè)LHON家系的外顯率為9.1%、28.5%和27.2%，與已報(bào)道的m.14502T＞C和m.3394T＞C在漢族LHON患者中占比相近，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于m.11778G＞A 突變的外顯率（10～90%）[19]。

在tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)圖中，我們發(fā)現(xiàn)m.12308A＞G 突變?cè)诘?4位上發(fā)生了堿基替換，17個(gè)物種的tRNALeu(CUN)序列在此位點(diǎn)高度保守。tRNALeu(CUN)第44位在tRNALeu(CUN)反密碼子莖最后一位與s段的交接位點(diǎn)處。tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)常為三葉草結(jié)構(gòu)，在20世紀(jì)70年代初科學(xué)家們用X射線衍生技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)為倒L形。tRNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)是氨基酸臂與TψC構(gòu)成L的橫，二氫尿嘧啶臂與反密碼臂及反密碼環(huán)共同構(gòu)成L的豎，s段的作用是在tRNA的L型三級(jí)結(jié)構(gòu)中負(fù)責(zé)連接這兩個(gè)區(qū)域（D環(huán)-反密碼子環(huán)和TψC-受體臂）[20-21]。在tRNA中第44位與第26位相互作用對(duì)tRNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的維持發(fā)揮一定作用[22]，推測此位點(diǎn)的改變可能影響tRNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

線粒體拷貝數(shù)是衡量線粒體數(shù)目的重要標(biāo)志。我們選取了3個(gè)LHON家系的先證者進(jìn)行線粒體拷貝數(shù)的測定，發(fā)現(xiàn)患者的線粒體數(shù)量相對(duì)于正常對(duì)照者明顯減少，提示tRNALeu(CUN)12308A＞G突變會(huì)造成線粒體數(shù)量減少，從而使細(xì)胞供能障礙。

在不同遺傳背景的LHON家系中，先證者均攜帶tRNALeu(CUN)12308A＞G突變且不攜帶3個(gè)發(fā)病率較高的LHON原發(fā)位點(diǎn)，說明tRNALeu(CUN)12308A＞G是LHON的潛在分子發(fā)病基礎(chǔ)，但在攜帶該突變的家系中發(fā)病率較低與患者患病程度較輕說明突變本身不足以造成LHON的表型表達(dá)，提示可能有其他修飾因子對(duì)這些家系發(fā)病起協(xié)同作用，包括環(huán)境因素、核基因[23]、表觀遺傳修飾[24]、線粒體單倍體型等[25]。