趙龍飛 袁玥 明聰

摘 ? 要：隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，在模式植物擬南芥中初步探索分析基因功能的方法日漸成熟。為了探索棉花GhERF14基因的功能，構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入擬南芥中，通過(guò)篩選純化獲得純合體轉(zhuǎn)基因植株，觀察表型，發(fā)現(xiàn)GhERF14基因?qū)M南芥的生長(zhǎng)狀況有一定的抑制作用，初步分析基因的功能為后續(xù)研究奠定一定的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：擬南芥;GhERF14基因;功能驗(yàn)證

1 ? 材料

野生型、擬南芥大腸桿菌感受態(tài)DH5α、農(nóng)桿菌菌株GV3101，植物過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-OCS（含KnptⅡ基因）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

2 ? 試驗(yàn)方法

2.1 ? 擬南芥pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF14過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

過(guò)表達(dá)載體在試驗(yàn)前期已經(jīng)構(gòu)建好的目的基因與帶有35S的過(guò)表達(dá)載體連接即可，方法可參照目的基因與PMD19-T的連接方法。

2.2 ? 電擊法轉(zhuǎn)化pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF

14重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌GV3101

將驗(yàn)證好的質(zhì)粒利用電擊的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。

2.3 ? 擬南芥侵染液配制

將含有pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF14重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌新鮮菌液1‰加入含有50 mg/L的Kan、50 mg/L的Rif的新鮮滅菌LB液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃、200 rpm的恒溫?fù)u床30～36 h，直至菌液呈橘黃色，菌液OD600值為0.6左右為止。緩沖液配置500 mL體系：MS Medium 1.185 g、蔗糖25 g、Swillter-77 150μL、乙酰丁香酮（AS）500μL。4 ℃，5 000 g離心沉淀?yè)u好的菌液，棄上清，用配制好的緩沖液在冰上懸浮，直至OD600值為0.5左右為止[1]。

2.4 ? 擬南芥的侵染

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥，取已經(jīng)盛開(kāi)的擬南芥植株，用剪刀去除果莢和花敗的花，將花蕾浸泡于已經(jīng)配制好的侵染液中，花蕾充分接觸侵染液，時(shí)間不超過(guò)1 min，對(duì)侵染結(jié)束的植株進(jìn)行遮光處理24 h，溫度為23 ℃。每間隔5～7 d侵染1次，直至擬南芥生育期結(jié)束，收取擬南芥T0代種子，去除雜質(zhì)，放于37 ℃恒溫烘箱中24 h后進(jìn)行篩選鑒定。

2.5 ? 擬南芥DNA的提取以及PCR檢驗(yàn)

取適量的新鮮擬南芥葉片，利用無(wú)菌研缽在液氮中研磨，然后根據(jù)Magen公司生產(chǎn)的植物DNA提取試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行，對(duì)提取的擬南芥DNA進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)DNA質(zhì)量好的模板進(jìn)行PCR檢驗(yàn)[2]。

2.6 ? 轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長(zhǎng)狀況調(diào)查

將轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥在溫度、光照、濕度相同的生長(zhǎng)環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株在苗期、抽薹期、成熟期的生長(zhǎng)狀況。

3 ? 結(jié)果與分析

3.1 ? 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性植株篩選

將驗(yàn)證正確的含有pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF14的農(nóng)桿菌GV3101，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥，對(duì)T0代種子進(jìn)行50 mg/L濃度的Kan檢驗(yàn)收取陽(yáng)性植株，對(duì)T1、T2、T3植株單株收取種子，并對(duì)T1代植株葉片提取DNA，進(jìn)行PCR凝膠電泳檢測(cè)[3]。

3.2 ? 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株表觀形態(tài)

在T1代分別選擇2個(gè)株系進(jìn)行單株收種，然后分別在相同的環(huán)境下種植并進(jìn)行篩選純化，分別以T2-1、T2-2作為標(biāo)記。轉(zhuǎn)基因擬南芥植株與野生型相比苗期生長(zhǎng)較慢，生育期延后當(dāng)野生型抽薹后，T2-1、T2-2才剛剛長(zhǎng)滿葉，通過(guò)對(duì)比T2-1、T2-2發(fā)現(xiàn)：T2-1相比T2-2長(zhǎng)勢(shì)更弱、更慢。推斷這可能與農(nóng)桿菌侵染的染色體的部位不同部分有關(guān)，T2-1植株長(zhǎng)勢(shì)最慢，可能是A、D染色體同時(shí)被侵染，雙供體侵染，具體原因還有待進(jìn)一步探究?？梢钥闯鲈摶蚩赡芘c植株的生長(zhǎng)發(fā)育有一定的關(guān)系。

當(dāng)轉(zhuǎn)基因株系開(kāi)始抽薹時(shí)，野生型株系已經(jīng)接近成熟，野生型株系比轉(zhuǎn)基因T2-2提前15 d。對(duì)比T2-1、T2-2株系，T2-2株系明顯比T2-1生長(zhǎng)得快，當(dāng)T2-2株系抽薹后4 d，T2-1才剛剛開(kāi)始抽薹?？梢钥闯?，棉花GhERF14不僅影響棉花的生長(zhǎng)，甚至?xí)七t生育期[4]。

轉(zhuǎn)基因擬南芥盛花結(jié)莢時(shí)與野生型相比，其生育期晚了15～20 d。當(dāng)轉(zhuǎn)基因株系與野生型株系都接近成熟時(shí)，野生型的株高和植株分枝情況都大于轉(zhuǎn)基因株系。同時(shí)轉(zhuǎn)基因株系T2-1與T2-2相比也比較弱，分枝更少，T2-1長(zhǎng)勢(shì)更弱，分枝少，說(shuō)明棉花GhERF14嚴(yán)重影響了植株的生長(zhǎng)發(fā)育和分枝狀況。

4 ? 討論與小結(jié)

通過(guò)觀察轉(zhuǎn)基因植株與野生型生長(zhǎng)狀況和生長(zhǎng)勢(shì)的差別發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株長(zhǎng)勢(shì)比較弱，生育期延后。植物抗病防御反應(yīng)的調(diào)控是非常復(fù)雜的，有許多轉(zhuǎn)錄因子家族扮演著重要的角色，對(duì)后續(xù)試驗(yàn)有一定的借鑒意義。

通過(guò)該試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該基因不僅可以調(diào)控植株對(duì)枯萎病菌的抗性，還具有調(diào)控植株生長(zhǎng)發(fā)育的作用，但是針對(duì)擬南芥中是否對(duì)枯萎病有響應(yīng)還有待探究，為該基因在生物學(xué)功能方面的研究奠定了基礎(chǔ)，有利于下一步試驗(yàn)的開(kāi)展，對(duì)后續(xù)試驗(yàn)有一定的借鑒意義。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] Concatenate Luis，Anderson Jonathan P，Young Jodi，et al.AtERF14，a member of the ERF family of transcription factors，plays a nonredundant role in plant defense[J].Plant Physio-logy，2006，143（1）.

[ 2 ] 趙曾強(qiáng).棉花GhWRKY44和GhWRKY22基因的克隆及功能初步分析[D].石河子：石河子大學(xué)， 2015.

[ 3 ] Singh K， Foley R C， Oate-Sánchez L. Transcription factorsin plant defense and stress responses[J].Curr.opin.plant Biol，2002，5（5）：430.

[ 4 ] Rushton P J，Somssich I E.Transcriptional control of plantgenes responsive to pathogens[J].Current Opinion in PlantBiology，1998，1（4）：311.