藺 萌 王亞婷 胡 軍 苗義艷 雷寧?kù)o

（鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河南·鄭州 450001）

醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教育中的一門重要實(shí)驗(yàn)課程，是醫(yī)學(xué)各專業(yè)的必修課程，要求醫(yī)學(xué)生掌握無菌操作和實(shí)踐培養(yǎng)。[1]在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中，細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)教學(xué)觀察主要是示教標(biāo)本觀察。芽孢和鞭毛屬于細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)，標(biāo)本制備可選用的菌種很多，本實(shí)驗(yàn)室主要使用的是破傷風(fēng)梭菌。破傷風(fēng)梭菌屬于革蘭氏染色陽性厭氧菌，能形成芽孢，有鞭毛，主要分布于土壤、人和動(dòng)物的腸道，是一種歷史悠久的梭狀芽胞桿菌。[2-3]本文主要對(duì)本實(shí)驗(yàn)室的芽孢和鞭毛標(biāo)本制備過程進(jìn)行總結(jié)，探討其它符合實(shí)驗(yàn)教學(xué)要求的菌種來源，并討論這種標(biāo)本制備方法是否能作為一項(xiàng)新的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容應(yīng)用到實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）破傷風(fēng)梭菌菌種，地表10cm 以下土壤；營(yíng)養(yǎng)瓊脂等。（2）95%乙醇，石碳酸復(fù)紅液，堿性美藍(lán)染液，飽和鉀明礬染液，堿性復(fù)紅乙醇飽和液等。（3）厭氧培養(yǎng)箱，無菌操作臺(tái)等。

1.2 方法

（1）菌種培養(yǎng)。復(fù)蘇破傷風(fēng)梭菌菌種，取菌液進(jìn)行三區(qū)劃線，厭氧培養(yǎng)24h，作為1 代，再選取平板中個(gè)體較大、中心密邊緣疏松的菌落，再次三區(qū)劃線培養(yǎng)24h，作為2 代，以此類推，傳代3 代以上增強(qiáng)細(xì)菌的活力。

（2）土壤中分離菌種。隨機(jī)取地表10cm 以下土壤5-10g，加入300mL生理鹽水，煮沸20min，冷卻至室溫，取上清液三區(qū)劃線，37℃厭氧培養(yǎng)72h，選取平板中個(gè)體較大、中心密邊緣疏松的單菌落，革蘭染色鑒定確認(rèn)為陽性菌，菌體芽孢呈鼓槌狀，位于菌體一端，為破傷風(fēng)梭菌。菌落接種于肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h 增菌。傳代至5-7 代以增強(qiáng)細(xì)菌的活力。

（3）芽孢染色。在載玻片中央滴加1 滴蒸餾水（約50 L），挑取傳菌3 代培養(yǎng)≥72h 的單菌落，按常規(guī)方法進(jìn)行涂片、干燥、固定，加石碳酸復(fù)紅液，持續(xù)5min 微火加熱并隨時(shí)滴加染液，水洗，95%乙醇脫色至脫不下紅色為止準(zhǔn)，水洗，滴加堿性美藍(lán)染液染色1min，濾紙吸干，顯微鏡下觀察到芽孢結(jié)構(gòu)。[4]

（4）鞭毛染色。提前將飽和鉀明礬染液200mL、5%石碳酸50mL、20%鞣酸液20mL 混合，加入堿性復(fù)紅乙醇飽和液10mL，混合后濾紙過濾（染色前再次過濾）。在載玻片中心靠一端的位置滴加2 滴蒸餾水（約100 L），挑取傳菌≥7 代培養(yǎng)16h 的單菌落，37℃靜置5min 使玻片始終處于濕潤(rùn)狀態(tài)，傾斜玻片使液體從另一端緩慢流下，用濾紙吸去多余菌液，室溫干燥，滴加染液染色5min，水洗，濾紙吸干，顯微鏡下觀察到鞭毛結(jié)構(gòu)。[5]

（5）高壓滅菌處理。所用土壤、菌液、平板、濾紙等物品在標(biāo)本制備完成后均經(jīng)過高壓滅菌處理。

2 結(jié)果

2.1 兩種來源的破傷風(fēng)梭菌芽孢染色標(biāo)本

由保存菌種制備的芽孢標(biāo)本中，芽胞呈圓形，芽孢位于菌體的一端，直徑比菌體粗，使菌體呈鼓槌狀（圖1-A）；由土壤中分離的菌種制備的芽孢標(biāo)本中，菌體呈鼓槌狀，芽胞呈圓形位于菌體的一端，與保存菌種制備的芽孢標(biāo)本形態(tài)特征相同（圖1-B）。

圖1 兩種來源的破傷風(fēng)梭菌芽孢染色(×1000)

2.2 兩種來源的破傷風(fēng)梭菌鞭毛染色標(biāo)本

由保存菌種制備的鞭毛標(biāo)本中，鞭毛分布于菌體四周（圖2-A）；由土壤中分離的菌種制備的鞭毛標(biāo)本中，鞭毛同樣分布于菌體四周，與保存菌種制備的鞭毛標(biāo)本形態(tài)特征相似（圖2-B）。

圖2 兩種來源的破傷風(fēng)梭菌鞭毛染色(×400)

3 討論

破傷風(fēng)梭菌屬于厭氧性細(xì)菌中的厭氧芽孢梭菌屬，是破傷風(fēng)的病原菌，在窄而深的傷口、有異物污染、大面積創(chuàng)傷、燒傷或同時(shí)有其它需氧菌或兼性厭氧菌混合感染，均易造成厭氧環(huán)境，導(dǎo)致菌體侵入人體，發(fā)芽繁殖而致病，是破傷風(fēng)梭菌感染的重要條件。[6]除創(chuàng)傷感染外，分娩時(shí)斷臍不潔，手術(shù)器械滅菌不嚴(yán)等，均可引起發(fā)病。[7-8]

醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，對(duì)破傷風(fēng)梭菌的觀察一般是觀察芽孢形態(tài)，因其周身有鞭毛，也可作為鞭毛標(biāo)本觀察的菌種。破傷風(fēng)梭菌的芽孢呈鼓槌裝，鞭毛分布于菌體四周。芽孢和鞭毛標(biāo)本制備是一項(xiàng)常規(guī)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。[9-10]本實(shí)驗(yàn)室所用的菌種主要是破傷風(fēng)梭菌菌種。破傷風(fēng)梭菌營(yíng)養(yǎng)要求不高，在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24-48h，可形成不規(guī)則的菌落，中心密周邊疏，直徑1mm 以上。[11]為了增加實(shí)驗(yàn)操作的趣味性和可操作性，本文對(duì)比了已保存菌種和土壤中分離的破傷風(fēng)梭菌制備的芽孢和鞭毛標(biāo)本，結(jié)果顯示兩種來源的菌種制備出來的標(biāo)本形態(tài)結(jié)構(gòu)相同，具有破傷風(fēng)梭菌芽孢和鞭毛的特征性，因此，從土壤中分離破傷風(fēng)梭菌可以作為一種新的菌種來源應(yīng)用到實(shí)驗(yàn)教學(xué)標(biāo)本制備過程中。實(shí)驗(yàn)材料來源于土壤，容易獲取，操作容易，可重復(fù)性高，在制備的芽孢和鞭毛標(biāo)本中，菌體形態(tài)完整，芽孢特征明顯，鞭毛排列相對(duì)整齊，顏色對(duì)比度大，實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中便于觀察。同時(shí)，可以結(jié)合實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，選擇土壤中不同菌種進(jìn)行分離純化，增加實(shí)驗(yàn)的多樣性。也可分析土壤中不同種類芽孢的數(shù)量比例，觀察不同芽孢結(jié)構(gòu)，分析土壤中可能存在的菌種種類，結(jié)合當(dāng)?shù)丨h(huán)境條件分析土壤中菌種對(duì)環(huán)境的影響等。

總之，微生物學(xué)是一門實(shí)踐性很強(qiáng)的學(xué)科，實(shí)驗(yàn)課程在微生物學(xué)教學(xué)中發(fā)揮了非常重要的作用。為了培養(yǎng)學(xué)生的動(dòng)手能力，應(yīng)不斷改進(jìn)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容和方法。而本實(shí)驗(yàn)室采用從土壤中分離破傷風(fēng)梭菌并制備芽孢和鞭毛標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)方法既可以增加標(biāo)本制備的菌種來源，也可以作為一項(xiàng)新的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)內(nèi)容應(yīng)用到實(shí)驗(yàn)教學(xué)中。