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(1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫 214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214122)

多孔淀粉是一種新型改性淀粉,與天然淀粉相比具有多孔海綿狀結(jié)構(gòu)和較大比表面積。因為這一結(jié)構(gòu)特性,多孔淀粉具備許多優(yōu)于天然淀粉的性能,如良好的吸附性能[1]。多孔淀粉作為淀粉的高附加值產(chǎn)品,可作為風味物質(zhì)載體、止血劑、重金屬離子吸附劑、脂肪替代物等,具有獨特的優(yōu)勢[2-4],在食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和化妝品等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[5-6]。

常見的多孔淀粉制備法有物理、化學(xué)和生物法[7-8]。其中,生物法是指通過酶作用淀粉的無定形區(qū),在淀粉顆粒上形成連接淀粉中心的孔洞的方法,被認為是一種簡便、安全、工業(yè)化的方法[9]。生物法制備多孔淀粉常用的酶有α-淀粉酶和糖化酶,它們的協(xié)同作用能夠有效提高多孔淀粉的制備效率。然而,天然淀粉由于其顆粒特性,如低比表面積和高比例的結(jié)晶區(qū)域,通常酶水解緩慢且效果不佳[10]。為了提高復(fù)合酶與淀粉的反應(yīng)效率,常采用前處理輔助天然淀粉的酶解。目前濕熱法、超聲波等前處理方法已被廣泛研究[11]。

反應(yīng)擠出是一種特殊的擠出加工技術(shù),指在擠壓過程中各種物料于擠出機內(nèi),在螺桿轉(zhuǎn)動下實現(xiàn)的物理、化學(xué)、生物反應(yīng)的過程。在擠壓過程中引入酶可在擠壓過程中加強酶對底物的作用。先前的研究表明,引入酶的反應(yīng)擠出技術(shù)可以產(chǎn)生多孔結(jié)構(gòu)[12-13]。反應(yīng)擠出可以增加淀粉的糊化度,使淀粉顆粒表面粗糙,增加淀粉對酶的敏感度,進而提高酶解效率[14]。然而,關(guān)于擠壓預(yù)處理反應(yīng)擠出聯(lián)合酶作用制備多孔淀粉的文獻資料較少。因此,研究反應(yīng)擠出與酶聯(lián)合對多孔淀粉制備的影響很有必要。

因此,本文采用反應(yīng)擠出作為前處理,聯(lián)合復(fù)合酶水解制備多孔淀粉,采用Placket-Burman Design(PBD)實驗、最陡爬坡實驗和Box-Benhnken Design(BBD)試驗優(yōu)化反應(yīng)擠出復(fù)合酶法聯(lián)合制備多孔淀粉工藝,使用掃描電鏡觀察四種不同類型的淀粉樣品,為優(yōu)化多孔淀粉制備工藝及多孔淀粉質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米淀粉 諸城興貿(mào)玉米開發(fā)有限公司;糖化酶(酶活81916 U/g，最適溫度60 ℃,最適pH4.0～4.5)、中溫α-淀粉酶(酶活2879 U/g，最適溫度50～70 ℃,最適pH5.5～7.5) 北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司;大豆油 嘉里糧油(中國)有限公司;檸檬酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、鹽酸等試劑 均為分析純。

FMHE36-24型雙螺桿擠壓機 螺桿直徑36 mm,長徑比24∶1，湖南富馬科食品工程技術(shù)有限公司;AL104型分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;EMS-30型恒溫水浴攪拌器 上海百典儀器設(shè)備有限公司;TDL-5A型離心機 無錫市瑞江分析儀器有限公司;DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海柏欣儀器設(shè)備廠;SU-1510掃描電子顯微鏡 日本日立株式會社;SCIENTZ-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵 長沙明杰儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 反應(yīng)擠出淀粉擠出物的制備 將玉米淀粉與中溫α-淀粉酶按照一定比例均勻混合30 min,置入喂料斗,擠壓過程中通過調(diào)節(jié)雙螺桿擠壓機的溫度、螺桿轉(zhuǎn)速、喂水量收集擠出物。擠出物經(jīng)冷凍干燥后,粉碎待用。

1.2.2 多孔淀粉的制備 實驗利用酶法制備多孔淀粉[1]。向250 mL錐形瓶中加入一定量的擠出物(或普通玉米淀粉——作為對照組)與磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液,混合均勻后加入糖化酶,在一定的溫度、pH、底物濃度、酶解時間下制備多孔淀粉。通過向體系中加入1 mL、4 mol/L的NaOH終止反應(yīng),15 min后加入1 mL、4 mol/L HCl平衡pH。將酶解液離心(4500 r/min,5 min),舍棄上清液并洗滌沉淀3次。將沉淀放入40 ℃烘箱中干燥24 h后研磨過100目篩,即得多孔淀粉。

1.2.3 Plackett-Burman試驗 根據(jù)前期單因素預(yù)實驗,設(shè)計實驗次數(shù)N=12的Plackett-Burman試驗[15],選取擠壓溫度(X1)、物料水分含量(X2)、螺桿轉(zhuǎn)速(X3)、α-淀粉酶添加量(X4)、酶解時間(X5)、糖化酶添加量(X6)、pH(X7)、酶解溫度(X8)、底物濃度(X9)為Plackett-Burman試驗設(shè)計因素。每個因素選取低、高兩個水平,高水平約為低水平的1.5倍。試驗因素與水平表見表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素與水平表Table 1 Variables and assigned concentrations of Plackett-Burman test

1.2.4 最陡爬坡試驗 將由Plackett-Burman試驗確定的影響實驗結(jié)果的顯著因素,根據(jù)系數(shù)估計值確定爬坡方向,將正系數(shù)因素的值按照一定步長逐步增加,負系數(shù)因素的值逐步減小,按照一定步長設(shè)計最陡爬坡試驗,尋求最佳響應(yīng)區(qū)域。

1.2.5 Box-Behnken響應(yīng)面試驗 在最陡爬坡試驗確定的最大響應(yīng)值區(qū)域內(nèi),以多孔淀粉吸油率為響應(yīng)值,以多孔淀粉制備中的主要因素物料水分含量、α-淀粉酶添加量、酶解時間、糖化酶添加量為因素,設(shè)計Box-Behnken試驗。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗因素與水平表Table 2 Factors and levels of Box-Behnken response surface test

1.3 指標測定

1.3.1 吸油率的測定 多孔淀粉對油的吸附屬于無選擇性吸附,可以通過吸油率來表征多孔淀粉的成孔情況[16-17]。將2 g淀粉樣品稱入50 mL燒杯中,與大豆油在室溫下不斷攪拌30 min。吸附后的大豆油和淀粉經(jīng)布氏漏斗抽濾5 min保證分離完全。吸附速率計算公式如下:

式中:m為樣品重量,g;m1為濾紙重量,g;m2為濾紙和過濾后樣品總重量,g。

1.3.2 掃描電鏡分析 干燥后的淀粉樣品用導(dǎo)電膠帶均勻地分布在樣品臺上,鍍金后在掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope,SEM)內(nèi)加壓觀察其微觀結(jié)構(gòu)[18],放大倍數(shù)為2500倍。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗采用Design-Expert 8.0進行方法設(shè)計,試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman篩選試驗

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果Table 3 Experimental design and result of Plackett-Burman design

表4 Plackett-Burman設(shè)計實驗結(jié)果方差分析及顯著性檢驗Table 4 Results of regression analysis of Plackett-Burman design

2.2 最陡爬坡試驗

最陡爬坡設(shè)計及結(jié)果如表5所示。隨著物料水分含量的減小,α-淀粉酶添加量、酶解時間及糖化酶添加量的增加,多孔淀粉的吸油率呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢。說明實驗號3比較接近最佳響應(yīng)區(qū)域。因此,以物料水分含量36%、α-淀粉酶添加量0.5%、酶解時間8 h、糖化酶添加量1.7%為試驗中心點設(shè)計Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

表5 最陡爬坡實驗結(jié)果Table 5 Results of the steepest ascent design

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.3.1 Box-Behnken 試驗設(shè)計 通過Box-Behnken試驗設(shè)計對物料水分含量、α-淀粉酶添加量、酶解時間、糖化酶添加量4個因素進行分析,得到Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表6,回歸方程顯著性檢驗及方差分析見表7。經(jīng)多元回歸分析,建立各因素與吸油率(Y)之間的二次回歸方程:Y=68.55+0.22A+0.53B-0.86C+0.65D-1.24AB+0.38AC-1.63AD-0.28BC+0.05BD-0.67CD-2.16A2-1.71B2-2.02C2-1.76D2

表6 Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Experiment design and results of response surface methodology from Box-Behnken design

表7 回歸方程顯著性檢驗及方差分析Table 7 Significance test and variance analysis of regression equation

2.3.2 Box-Behnken響應(yīng)面曲面交互作用分析 圖1為影響吸油率的各個因素之間的響應(yīng)面曲面交互作用圖。通過判斷等高線的圓形程度和響應(yīng)面的坡度,判斷各個因素之間的交互作用。響應(yīng)面坡度越陡峭,等高線越密集,說明響應(yīng)值對該條件的改變越敏感,該因素對吸油率的影響越大[20-21]。AB、AD之間存在極顯著交互作用,且響應(yīng)值最優(yōu)點均在試驗考察的區(qū)域范圍內(nèi)。

圖1 物料水分含量、α-淀粉酶添加量、酶解時間、糖化酶添加量對多孔淀粉吸油率影響的響應(yīng)面Fig.1 Response surface of the effects of water supply,α-amylase addition,enzymolysis time and glucoamylase addition on the oil absorption of porous starch

2.3.3 驗證試驗 通過對響應(yīng)面圖的分析可以得出,吸油率Y存在最大值。利用Design-Expert可得對應(yīng)因素物料水分含量取35.7%,α-淀粉酶添加量取0.52%,酶解時間7.7 h,糖化酶添加量取1.73%。此時吸油率達到最大值68.83%。考慮到實驗條件的可操作性,將最優(yōu)條件修正為:物料水分含量取36%,α-淀粉酶添加量取0.52%,酶解時間7.7 h,糖化酶添加量取1.73%。為了驗證模型的準確性,在修正條件下進行驗證,取三次重復(fù)試驗平均值,所得吸油率為68.49%,與預(yù)測值基本相符(相對誤差為0.58%),說明通過Design-Expert確定最大值是可靠的[21]。而采用復(fù)合酶水解得到的對照多孔淀粉的吸油率59.57%,試驗組的多孔淀粉吸油率提高了14.97%。

2.4 多孔淀粉微觀結(jié)構(gòu)分析

圖2為不同方式處理得到的淀粉樣品的掃描電鏡圖片。天然玉米淀粉為一種表面光滑的球形和橢圓形顆粒,其粒徑在5～26 μm之間[22]。經(jīng)過酶解處理后的多孔淀粉顆粒(圖2b)表面有較大孔洞,然而,這些孔洞分布數(shù)量較少且不均勻。經(jīng)過反應(yīng)擠出處理的淀粉(圖2c)表面形成小的、數(shù)量較多的孔,這些孔增大了淀粉的比表面積,且可成為酶易攻擊的位點[23-25]。圖2d為反應(yīng)擠出聯(lián)合復(fù)合酶水解形成的多孔淀粉,可以看到孔的分布較均勻,孔數(shù)量增大,比表面積增加,導(dǎo)致吸油率升高。

圖2 多孔淀粉的掃描電鏡圖(2500×)Fig.2 Scanning electron micrography of native starch(2500×)注:a為普通玉米淀粉;b為由普通玉米淀粉水解制備的對照多孔淀粉;c為反應(yīng)擠出玉米淀粉;d為反應(yīng)擠出聯(lián)合酶水解法得到的多孔淀粉。

3 結(jié)論

本研究以玉米淀粉為原料,多孔淀粉吸油率為指標,利用Placket-Burman Design試驗、最陡爬坡試驗和Box-Benhnken Design試驗對反應(yīng)擠出聯(lián)合復(fù)合酶法制備多孔淀粉工藝進行優(yōu)化,最佳工藝參數(shù)為:物料水分含量36%、α-淀粉酶添加量0.52%、酶解時間7.7h、糖化酶添加量1.73%,擠壓溫度70 ℃、螺桿轉(zhuǎn)速120 r/min、pH5.0、酶解溫度50 ℃、底物濃度25%,此條件下制備的多孔淀粉吸油率達到最大值68.49%,較對照組提高了14.97%。反應(yīng)擠出與酶l h作用方法有效提高了多孔淀粉的制備效率,產(chǎn)品在孔的數(shù)量、孔徑大小、分布均一性等方面,都較天然淀粉酶解法制備方法有了明顯的提升,且制備過程不涉及有機試劑,是一種對環(huán)境友好的多孔淀粉制備新方法。該研究為高效制備高品質(zhì)多孔淀粉提供了一種新的途徑,可進一步為反應(yīng)擠出與酶聯(lián)合制備多孔淀粉的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù),可廣泛作為吸附劑和封裝劑應(yīng)用于各種食品中。另外,反應(yīng)擠出聯(lián)合復(fù)合酶法制備得到的多孔淀粉,其吸附解析等理化特性以及不同應(yīng)用場合的具體問題還有待進一步研究。