,2,*

(1.河北北方學(xué)院食品科學(xué)系,河北張家口 075000)(2.河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全分析檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北張家口 075000)(3.張家口市食品藥品檢測(cè)中心,河北張家口 075000)

亞麻(Linumusitatissimum)別名為胡麻,是亞麻科、亞麻屬一年生草本植物,主要分布在俄羅斯、加拿大、中國(guó)、印度和哈薩克斯坦等國(guó)家[1-2]。亞麻籽(flaxseed或linseed)即亞麻的種子,為紅棕色果實(shí),表面平滑有光澤,有極強(qiáng)的堅(jiān)果風(fēng)味[3]。亞麻籽含有蛋白質(zhì)、油脂、木質(zhì)素和亞麻膠等成分,其中脂肪含量為30%～40%,含有飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸和大量的多不飽和脂肪酸;其中蛋白質(zhì)含量為21.9%～38.6%,必需氨基酸種類齊全且評(píng)分較高,含有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值;加工性能良好,可應(yīng)用在食品中[4-7]。

目前我國(guó)油用亞麻產(chǎn)業(yè)比較薄弱,產(chǎn)品僅限于亞麻油,榨油之后的剩余物餅粕一般作為動(dòng)物飼料,導(dǎo)致較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的植物性蛋白質(zhì)資源沒有得到有效的利用,阻礙了亞麻蛋白資源的開發(fā)以及在食品工業(yè)中的應(yīng)用[8-12]?，F(xiàn)在全球面臨糧食危機(jī),充分利用糧油加工副產(chǎn)物,挖掘亞麻籽餅粕的資源潛力,不僅可以增加糧食來源,還可以開發(fā)出新的食品資源,增加企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益,促進(jìn)農(nóng)民增收,推動(dòng)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展[13-15]。

亞麻蛋白的提取方法有堿溶酸沉法,但是在較高的堿性環(huán)境下會(huì)破壞蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)特性,并加深產(chǎn)品色澤[16]。近幾年來開始用酶法提取蛋白質(zhì),具有反應(yīng)條件溫和、時(shí)間短、提取率高,能更多的保留蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)功能等優(yōu)點(diǎn)[17-18]。張慧君等[19]采用復(fù)合酶水解技術(shù)結(jié)合堿溶酸沉的方法從亞麻餅粕中提取亞麻蛋白,通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)pH、時(shí)間、料液比、溫度進(jìn)行優(yōu)化,最終的提取率達(dá)64.26%。

酶法提取蛋白質(zhì)反應(yīng)條件溫和,能夠避免堿溶酸沉法對(duì)蛋白質(zhì)帶來的負(fù)面影響。且能夠更多的保留蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,所以本試驗(yàn)采用酶法亞麻籽餅粕中的亞麻蛋白。以榨油后的亞麻籽餅粕為原料,先進(jìn)行脫脂、脫膠處理,然后在果膠酶、纖維素酶、植酸酶、α-淀粉酶各自最適的條件下進(jìn)行篩選,以亞麻蛋白提取率為考察指標(biāo),選擇提取率較高的酶。通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化得到酶法提取亞麻蛋白的工藝條件,探討加酶量、溫度、浸提pH和時(shí)間4個(gè)因素對(duì)亞麻籽蛋白提取率的影響,確定最佳的工藝參數(shù),為亞麻籽蛋白的進(jìn)一步開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

亞麻籽餅粕 來自康保明光糧油有限公司,外觀整齊,無霉變;果膠酶(500 U/mg)、植酸酶(5 U/mg)、纖維素酶(50 U/mg) 上海赫鵬新生物科技有限公司;α-淀粉酶(≥3700 U/g) 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;考馬斯亮藍(lán)-G250 北京亞米生物科技有限公司;牛血清蛋白 北京博爾西科技有限公司;石油醚、正己烷 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉 天津市永大化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;鹽酸 北京化工廠。

PHS-3C酸度計(jì) 上海佑科儀表有限公司;HC-3018高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;79-1磁力加熱攪拌器 常州澳華儀器有限公司;DS-T300高速多功能粉碎機(jī) 上海市頂帥工貿(mào)有限公司;UV76紫外可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司;HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠;HY-4A調(diào)速振蕩器 常州澳華儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脫膠、脫脂亞麻籽餅粕的制備 參照張澤生等[20]的做法并稍作修改,亞麻籽餅粕粉碎過篩(80目),加入20倍的蒸餾水、溫度為75 ℃,提取時(shí)間為90 min,洗膠次數(shù)為3次,進(jìn)行脫膠。烘干亞麻籽餅粕加入30倍的正己烷,振蕩6 h,回收正己烷,餅粕于通風(fēng)櫥晾12 h即為脫脂亞麻籽餅粕。

1.2.2 基本成分的測(cè)定 亞麻籽餅粕中脂肪的測(cè)定:根據(jù)《GB/T 5009.6-2016 食品中脂肪的測(cè)定》中第一法索氏抽提法測(cè)定;水分的測(cè)定:根據(jù)GB 5009.3-2016《食品中水分的測(cè)定》中第一法直接干燥法測(cè)定;粗蛋白的測(cè)定:根據(jù)GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的第一法凱氏定氮法測(cè)定;灰分的測(cè)定:根據(jù)GB 5009.4-2016《食品中灰分的測(cè)定》中的第一法食品中總灰分的測(cè)定來測(cè)定;淀粉的測(cè)定:根據(jù)GB 5009.9-2016《食品中淀粉的測(cè)定》中的第二法酸水解法測(cè)定;纖維素的測(cè)定:根據(jù)GB/T 5515-2008《糧食中粗纖維素含量測(cè)定》中的介質(zhì)過濾法測(cè)定。

1.2.3 亞麻蛋白提取工藝 稱取1 g脫膠、脫脂亞麻籽餅粕粉,加15 mL 蒸餾水及酶,調(diào)pH至6,60 ℃水浴振蕩3 h,100 ℃滅酶,4000 r/min離心15 min,考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)含量(清蛋白);收集沉淀物,加入15 mL 0.5%的NaCl溶液,振蕩30 min,4000 r/min離心15 min,收集上清液測(cè)定蛋白質(zhì)含量(球蛋白);收集沉淀物,加入15 mL 70%的乙醇,振蕩30 min,4000 r/min離心15 min,收集上清液測(cè)定蛋白質(zhì)含量(醇溶蛋白);收集沉淀物,加入15 mL 0.2%的NaOH,振蕩30 min,4000 r/min離心15 min,收集上清液測(cè)定蛋白質(zhì)含量(球蛋白)。然后將清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和球蛋白的含量加起來即為提取亞麻蛋白的含量。

1.2.4 最佳糖化酶的篩選 選α-淀粉酶、纖維素酶、植酸酶、果膠酶這四種糖酶水解亞麻蛋白,條件見表1,使酶活力達(dá)到2000 U/g,按各自最適合的條件下水解4 h,以亞麻蛋白的提取率為指標(biāo),篩選出最適合亞麻籽餅粕酶解的糖酶。

表1 各種酶的反應(yīng)條件Table 1 Reaction conditions of various enzymes

1.2.5 單因素試驗(yàn) 根據(jù)1.2.4的篩選蛋白質(zhì)提取率最高的一種酶,對(duì)酶的添加量、亞麻蛋白的提取溫度、亞麻蛋白的浸提pH、亞麻蛋白的提取時(shí)間四個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.1 加酶量對(duì)提取率的影響 稱取亞麻籽餅粕,按料液比1∶15 g/mL加入蒸餾水,分別按原料的1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%加入α-淀粉酶,在55 ℃下調(diào)節(jié)亞麻籽餅粕反應(yīng)體系的pH為6,設(shè)定提取時(shí)間為3.5 h,確定適宜的添加劑量。

1.2.5.2 提取溫度對(duì)提取率的影響 稱取亞麻籽餅粕,按料液比1∶15 g/mL加入蒸餾水,按原料的2%加α-淀粉酶,分別在50、55、60、65、70、75 ℃下調(diào)節(jié)亞麻籽餅粕反應(yīng)體系的pH為6.00,提取時(shí)間為3.5 h的情況下來選出最適的提取亞麻蛋白的溫度。

1.2.5.3 pH對(duì)提取率的影響 稱取亞麻籽餅粕,按料液比1∶15 g/mL加入蒸餾水,按原料的2%加α-淀粉酶,在55 ℃下分別調(diào)節(jié)亞麻籽餅粕反應(yīng)體系的pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,設(shè)定時(shí)間為3.5 h的情況下來選出最適的提取亞麻蛋白的溫度。

1.2.5.4 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響 稱取亞麻籽餅粕,按料液比1∶15 g/mL加入蒸餾水,按原料的2%加α-淀粉酶,在55 ℃下調(diào)節(jié)亞麻籽餅粕反應(yīng)體系的pH為6,設(shè)定時(shí)間為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h的情況下來選出最適的提取亞麻蛋白的溫度。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以加酶量(A)、提取溫度(B)、提取pH(C)、提取時(shí)間(D)為因素,亞麻蛋白提取率(Y)為響應(yīng)值,利用Design Expert 8.06軟件,進(jìn)行響應(yīng)面的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 2 Experimental factors and levels of response surface design

1.2.7 亞麻蛋白提取率的測(cè)定和計(jì)算 亞麻籽餅粕中蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法測(cè)定。

提取蛋白質(zhì)含量采用SN/T3926-2014《出口乳、蛋、豆類食品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定》—考馬斯亮藍(lán)法[21],并用牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)得蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.6177x-0.0063,R2=0.9933。

蛋白質(zhì)提取率(%)=提取蛋白含量(g)/亞麻籽餅粕中蛋白質(zhì)含量(g)×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Design Expert 8.06軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻籽餅粕基本成分的測(cè)定結(jié)果

隨著人們生活水平的日益上升,人們對(duì)蛋白質(zhì)的要求更高,因此不僅要開發(fā)新的蛋白質(zhì)資源,還要加強(qiáng)對(duì)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的研究。大米的蛋白質(zhì)含量約為8%,玉米的蛋白含量約為10%,高梁、燕麥等作物的蛋白質(zhì)含量約在12%左右,谷糠蛋白含量在13%左右[22],而亞麻餅粕中蛋白質(zhì)含量高達(dá)30.67%,且在我國(guó)一般作為動(dòng)物的飼料或者是直接丟棄,所以說亞麻餅粕中的蛋白質(zhì)具有一定的開發(fā)意義，其可作為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的來源[23]。

表3 亞麻籽餅粕基本成分Table 3 Basic components of flaxseed meal

2.2 篩選最佳酶制劑

如圖1所示,亞麻蛋白的提取率從大到小表現(xiàn)為:α-淀粉酶(61.52%)>纖維素酶(56.63%)>植酸酶(55.26%)>果膠酶(47.46%)。因此選擇α-淀粉酶做為提取酶制劑。因?yàn)楦鞣N酶作用底物不同,淀粉酶水解底物為淀粉,果膠酶水解底物為果膠,纖維素酶水解底物為纖維素,植酸酶水解底物為植酸,各種糖酶的活力不一。因此為保證酶的充分作用,將酶的添加量統(tǒng)一按酶底比添加。雖然淀粉酶的活性最低,但是它的作用效果最好,提取率最高。

圖1 最佳糖酶篩選結(jié)果Fig.1 The best screening results of glycose

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 加酶量對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖2可知,當(dāng)加酶量從1.0%增加至2.5%時(shí),亞麻蛋白的提取率呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì);當(dāng)加酶量從2.5%增加至3.5%時(shí),亞麻蛋白提取率呈平緩趨勢(shì)。說明當(dāng)α-淀粉酶的添加量較少時(shí),α-淀粉酶能夠與底物充分結(jié)合,當(dāng)加酶量大于2.5%時(shí),底物濃度過低,提取率不再上升。一般來講,加酶量越高提取成本越大,因此加酶量采用2.5%為宜。

圖2 加酶量對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on protein extraction rate

2.3.2 提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖3可知,當(dāng)溫度從50 ℃增加到60 ℃時(shí),隨著提取溫度的不斷升高,亞麻蛋白提取率呈現(xiàn)上升趨勢(shì);提取溫度從60 ℃增加到75 ℃時(shí),亞麻蛋白的提取率呈下降趨勢(shì),這可能與溫度升高后蛋白質(zhì)變性有關(guān)。所以選擇60 ℃作為亞麻蛋白的提取溫度。

圖3 提取溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effect of temperature on protein extraction rate

2.3.3 pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖4可知亞麻蛋白提取率在pH5.0～7.5范圍內(nèi)的變化情況。pH的變化會(huì)影響帶電性,的帶電性直接影響蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-溶液的相互作用,從而影響蛋白質(zhì)的溶解性,最終影響蛋白質(zhì)的提取率[24]。在試驗(yàn)pH范圍內(nèi),當(dāng)pH從5.0增至6.5時(shí),隨著pH的增加,亞麻蛋白的提取率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì);當(dāng)pH從6.5增至7.5時(shí),隨著pH的增加,亞麻蛋白的提取率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),因此較適宜pH為6.5。

圖4 pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.4 Effect of pH on protein extraction rate

2.3.4 提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響 由圖5可知2.0～4.5 h內(nèi)亞麻蛋白提取率的變化情況。當(dāng)提取時(shí)間從2.0 h增至3.5 h時(shí),隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),亞麻蛋白提率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì);當(dāng)時(shí)間從3.5 h增至4.5 h時(shí),隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),亞麻蛋白提取率趨于平緩,不再上升。從經(jīng)濟(jì)方面來考慮,較合適的時(shí)間選為3.5 h。

圖5 提取時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on protein extraction rate

2.4 響應(yīng)面對(duì)提取試驗(yàn)的優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在通過單因素獲得最佳條件后,接著用Design-Expert.V8.0軟件中的Box-Benhnken進(jìn)行設(shè)計(jì),以加酶量、提取溫度、pH和提取時(shí)間為變量,以提取率為響應(yīng)值進(jìn)行分析,設(shè)計(jì)結(jié)果見表4。

表4 方案設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Scheme design and results of response surface method test

對(duì)表4中的數(shù)據(jù)用響應(yīng)面軟件進(jìn)行方差分析,得到Y(jié)對(duì)A、B、C和D的二次多項(xiàng)回歸模為:Y(%)=66.71+0.74A+0.30B+0.71C+1.52D-0.078AB-2.43AC+0.14AD-0.54BC+0.31BD+0.085CD-7.51A2-1.60B2-0.69C2-7.63D2,由表5可知,回歸模型的P<0.0001,表現(xiàn)為極顯著,失擬項(xiàng)P>0.05,表現(xiàn)為不顯著,R2=0.9045>0.9,表明模型復(fù)合本次試驗(yàn)的結(jié)果,所以可以用此模型分析和預(yù)測(cè)提取亞麻籽餅粕中亞麻蛋白工藝的優(yōu)化。

表5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差及顯著性分析Table 5 Variance and significance analysis of the expeimental results

2.4.2 各因素交互影響分析 由圖6可知,在α-淀粉酶提取亞麻籽餅粕中蛋白的工藝中,亞麻蛋白提取率隨著各因素的增大而逐漸增,當(dāng)亞麻蛋白提取率增至極值后,隨著各因素的增大,提取率則逐漸減小。響應(yīng)面的值影響越大的因素,那么該曲面就會(huì)越陡,各因素彼此之間交互影響的強(qiáng)弱大小是通過等高線的形狀來反映的。用圓形和橢圓形分別來表示影響因素相互作用的不顯著性和顯著性[25]。影響亞麻蛋白提取率的主次順序?yàn)?D>A>C>B。當(dāng)酶的添加量一定時(shí),提取溫度變化對(duì)提取率影響不明顯;當(dāng)酶添加量不變時(shí),亞麻蛋白提取率在4 h前增加,4 h后降低。當(dāng)提取時(shí)間固定時(shí),當(dāng)添加的酶量約為2.5%時(shí),亞麻蛋白的提取率最優(yōu)。若添加的酶的量大于約2.5%,提取率不會(huì)發(fā)生顯著變化。當(dāng)pH一定時(shí),隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng),提取率是不斷上升的,當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí),亞麻蛋白質(zhì)的提取率隨提取pH的增長(zhǎng)無明顯變化。

圖6 各因素交互作用對(duì)影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response flour and contour lines of interaction of various factors to influence

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)預(yù)測(cè)的最佳提取條件為:加酶量2.52%、溫度60 ℃、pH6.04、時(shí)間4.06。理論值提取率為65.54%。為了檢測(cè)模型的準(zhǔn)確性,對(duì)最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證?？紤]到操作實(shí)際性,將條件進(jìn)行修正,加酶量2.5%,溫度60 ℃,pH6,時(shí)間4 h,進(jìn)行三次試驗(yàn)取平均值,得到實(shí)際的亞麻蛋白的提取率為接近略低于理論值為64.15%,與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差是2.1%。說明建立的模型和實(shí)際情況比較符合。

3 結(jié)論

在單因素的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面試驗(yàn)研究4個(gè)因素對(duì)亞麻蛋白提取率的影響,優(yōu)化亞麻蛋白的提取工藝條件,根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)建立的二次多項(xiàng)式模型具有良好的顯著性。α-淀粉酶提取亞麻籽餅粕中亞麻蛋白的最理想工藝條件為:α-淀粉酶用量2.5%,溫度60 ℃,pH6,時(shí)間4 h,亞麻蛋白提取率為64.15%。同時(shí),根據(jù)響應(yīng)面分析,各影響因素對(duì)蛋白質(zhì)提取率的作用大小依次為:提取時(shí)間>加酶量>pH>提取溫度。雖然本文的提取率與張慧君等[19]得到的提取率相差不大,但是她的試驗(yàn)方法結(jié)合了堿溶酸沉法,據(jù)報(bào)道堿溶酸沉法對(duì)蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)不利[26],酶法則能夠更好的保留蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。用α-淀粉酶對(duì)亞麻籽餅粕進(jìn)行脫膠、脫脂的預(yù)處理之后,再來提取亞麻蛋白質(zhì),為亞麻蛋白資源的進(jìn)一步開發(fā)提供基礎(chǔ)理論研究技術(shù)。