郭 燕，賀 晨，段 勇，現(xiàn)紅斌，張 歡，李 錦

（陜西省血液中心，西安 710061）

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase,ALT）水平異常是肝臟損傷的敏感標(biāo)志，曾被當(dāng)作篩選肝炎病毒，尤其是丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）感染的替代指標(biāo)，一定程度上保障了輸血安全。隨著酶免篩查試劑靈敏度的不斷提高及核酸檢測(cè)技術(shù)（nucleic acid testing，NAT）的廣泛開(kāi)展，美英等發(fā)達(dá)國(guó)家以及我國(guó)港澳臺(tái)地區(qū)，在常規(guī)開(kāi)展血液NAT后即取消了ALT檢測(cè)[1]。ALT雖然目前仍是我國(guó)《無(wú)償獻(xiàn)血健康體檢要求》（GB18647-2011）規(guī)定的必檢項(xiàng)目，但大量學(xué)者研究結(jié)果顯示獻(xiàn)血人群中ALT水平異常與HBV，HCV感染并無(wú)相關(guān)性[2-4]，認(rèn)為取消ALT檢測(cè)或提高ALT檢測(cè)域可以有效降低獻(xiàn)血者淘汰率和血液報(bào)廢率。

然而，也有研究提示ALT對(duì)HCV檢出有輔助作用，如CASTILLO等[5]在100例抗-HCV陰性，血清HCV RNA陰性，肝功能持續(xù)異常的患者中檢到HCV RNA，命名為“隱匿性丙型肝炎病毒感染（occult hepatitis C virus infection，OCI）”；LIN等[6]在113例ALT水平異常獻(xiàn)血者中檢出9例（7.96%）OCI，對(duì)照組并未檢出。ALT水平異常與獻(xiàn)血人群HBV，HCV感染是否相關(guān)？ALT對(duì)OCI獻(xiàn)血者是否有篩查作用？本文針對(duì)上述問(wèn)題開(kāi)展研究，現(xiàn)報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 98 697份血液標(biāo)本來(lái)自陜西省血液中心2019年1～6月初篩合格的無(wú)償獻(xiàn)血者，男性61 814人，女性36 883人，年齡18～60周歲。此外，隨機(jī)選擇2019年7～9月初篩合格的無(wú)償獻(xiàn)血者112例，ALT初篩＞50U/L的無(wú)償獻(xiàn)血者125例，男性176例，女性61例,年齡18～60周歲。每個(gè)獻(xiàn)血者同時(shí)留取3管標(biāo)本（EDTA-K2抗凝真空管），2管用于血型、酶聯(lián)免疫檢測(cè)和外周血淋巴細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）提取，1管用于核酸檢測(cè)。本研究經(jīng)陜西省血液中心醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參與研究的獻(xiàn)血者均自愿簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑和儀器 HBsAg，抗-HIV-1和抗-HIV-2，抗-HCV，抗-TP檢測(cè)試劑盒分別購(gòu)自北京萬(wàn)泰，美國(guó)伯樂(lè)，珠海麗珠，上?？迫A和意大利索靈公司；PBMCs提取和HCV RNA檢測(cè)試劑包括天津?yàn)笕薖BMCs分離液（LTS1077-1）；先鋒生物RNAfast1000總RNA提取試劑盒（RN03）；PromegaGoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（A5001）。實(shí)驗(yàn)儀器包括olympus AU640全自動(dòng)生化分析儀；Hamilton Fame全自動(dòng)酶免分析儀；COBAS S 201核酸檢測(cè)系統(tǒng)；ABI 2720 PCR儀；BIO RAD GelDoc EZ凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 血液檢測(cè)：陜西省血液中心對(duì)無(wú)償獻(xiàn)血者血液樣本采用獻(xiàn)血前初篩和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)兩個(gè)步驟。初篩項(xiàng)目包括Hb，HBV，HIV，ALT（≤50U/L為合格），合格者繼續(xù)完成獻(xiàn)血，不合格者延緩/停止獻(xiàn)血。實(shí)驗(yàn)室則采用兩個(gè)不同廠家酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑對(duì)HBsAg，抗-HIV-1和抗-HIV-2，抗-HCV，抗-TP進(jìn)行兩輪檢測(cè)，ALT采用速率法進(jìn)行1次檢測(cè)（ALT復(fù)檢），任一項(xiàng)目陽(yáng)性者視為不合格，無(wú)需進(jìn)行NAT檢測(cè)。合格樣本采用COBAS S 201核酸檢測(cè)系統(tǒng)（6樣本混樣模式，6×167μl）繼續(xù)進(jìn)行HCV，HIV，HBV核酸檢測(cè)，有反應(yīng)性的混樣池進(jìn)行拆分試驗(yàn)，鑒定出陽(yáng)性標(biāo)本。

1.3.2 PBMCs分離提?。簭?ml外周血中分離PBMCs，嚴(yán)格參照說(shuō)明書(shū)操作，血液自采集至PBMCs收集不超過(guò)6h。分離的PBMCs經(jīng)500μl 1×PBS洗滌兩遍后加入500μl細(xì)胞凍存液，立即凍存于- 80℃冰箱，每管細(xì)胞數(shù)為1×106～1×107。

1.3.3 HCV RNA提取和檢測(cè)：PBMCs 37℃迅速融化，500μl 1×PBS洗 滌 兩次，細(xì) 胞總RNA提取及cDNA合成嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。Nested PCR檢測(cè)HCV RNA5’非編碼區(qū)[6]，兩輪PCR引物分別是F1：5’-CTGTGAGGAACTACTGTCT-3’(nt45～63),R1:5’-GTGCACGGTCTACGAGACCT-3’(nt321～302)；F2∶5’GAAAGCGTCTAGCCATGGCGT-3’(nt71～91),R2∶5’CCCTATCAGGCAGTACCACAA-3’(nt301～281)。4μl cDNA為模板，反應(yīng)條件為95℃ 3min；95℃ 30s,58℃ 30s,72℃30s；72℃ 8min，40個(gè)循環(huán)，第二輪PCR吸取4μl第一輪PCR產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增條件相同。

慢性丙型肝炎患者PBMCs HCV RNA陽(yáng)性標(biāo)本；抗-HCV陰性且血漿及PBMCs HCV RNA陰性標(biāo)本；ddH2O分別作為陽(yáng)性、陰性和空白對(duì)照以排除污染。目的產(chǎn)物230bp，切膠回收后送金唯智生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料運(yùn)用χ2檢驗(yàn)，均數(shù)組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 無(wú)償獻(xiàn)血者ALT，HBV，HCV檢測(cè)結(jié)果 98 697份血液標(biāo)本中ALT水平異常者654份（0.66%），其中ALT單項(xiàng)水平異常641份（98.01%）；ALT異常并發(fā)HBsAg陽(yáng)性5份，占ALT不合格總數(shù)的0.76%（5/654）；ALT異常并發(fā)抗-HCV陽(yáng)性3份，占ALT不合格總數(shù)的0.46%（3/654）；ALT并發(fā)肝炎病毒標(biāo)志物陽(yáng)性者，僅占ALT不合格標(biāo)本的1.22%（8/654）。HBsAg單項(xiàng)陽(yáng)性388份（0.39%），抗-HCV單項(xiàng)陽(yáng)性448份（0.45%）。

2.2 肝炎病毒標(biāo)志物陽(yáng)性組與陰性組ALT異常率比較 見(jiàn)表1。HBsAg陽(yáng)性組和陰性組，抗-HCV陽(yáng)性組和陰性組的ALT異常率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.23，0.00，均P＞0.05）。HBsAg陰性組、抗-HCV陰性組ALT均值高于對(duì)應(yīng)陽(yáng)性組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.662，0.282，均P＞0.05）。

表1 肝炎病毒標(biāo)志物陽(yáng)性組與陰性組 ALT均值及異常率比較

2.3 ALT初篩不合格獻(xiàn)血者HBV，HCV感染率及ALT水平比較 見(jiàn)表2。125例初篩ALT不合格的無(wú)償獻(xiàn)血者HBsAg陽(yáng)性組ALT水平小于HBsAg陰性抗-HCV陰性組，抗-HCV陽(yáng)性組ALT大于HBsAg陰性抗-HCV陰性組,組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.527，1.396，均P＞0.05）。ALT初篩不合格者HBV,HCV感染率(4.8%，6/125)大于ALT初篩合格者（0.86%，844/98 697）和復(fù)檢ALT不合格者（1.22%，8/654），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=22.78，7.61，均P＜0.05）。

表2 ALT初篩不合格獻(xiàn)血者HBV，HCV感染率[n（%）] 及ALT水平（±s，U/L）比較

表2 ALT初篩不合格獻(xiàn)血者HBV，HCV感染率[n（%）] 及ALT水平（±s，U/L）比較

組別 感染率 ALT HBsAg+3（2.46）64.73±13.96抗-HCV+3（2.46）149.47±94.71 HBsAg-抗-HCV- 119（95.20）73.05±27.13

2.4 NAT檢測(cè)結(jié)果 酶免及ALT檢測(cè)均合格樣品中，NAT檢出HBV DNA陽(yáng)性46份(0.05%，46/96 585)；ALT單項(xiàng)異常的樣品NAT檢出HBV DNA陽(yáng)性1份（0.16%，1/641），兩組HBV DNA檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.98，P＞0.05）。收集的125例ALT初篩單項(xiàng)不合格樣品，酶免檢測(cè)篩除HBV，HCV陽(yáng)性后，剩余119例樣品和112份ALT初篩合格樣品NAT檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.5 無(wú)償獻(xiàn)血者中OCI篩查結(jié)果 119例ALT單項(xiàng)異常者PBMCs中檢出1例HCV RNA陽(yáng)性，112例合格獻(xiàn)血者PBMCs中未檢出HCV RNA。

3 討論

ALT是病毒性肝炎的一項(xiàng)非特異性檢測(cè)指標(biāo)，除病毒性肝炎、肝硬化、肝癌、藥物性肝炎等病理因素外，與年齡、體重、飲酒、劇烈運(yùn)動(dòng)、疲勞、藥物服用等非病理因素也有一定相關(guān)性[7]。我們的檢測(cè)結(jié)果顯示，ALT初篩合格的無(wú)償獻(xiàn)血人群中ALT水平異常與HBV，HCV感染并無(wú)關(guān)聯(lián)性。然而，由于初篩往往會(huì)排除ALT較高的獻(xiàn)血者，只利用ALT初篩合格樣品作為研究對(duì)象存在一定局限性。本研究中,初篩ALT不合格樣品的HBsAg/抗-HCV陽(yáng)性率（4.8%）高于ALT初篩合格獻(xiàn)血者（0.86%）及ALT復(fù)檢不合格者（1.22%），一定程度上體現(xiàn)了ALT初篩對(duì)于防止血液資源浪費(fèi)的必要性。此外，對(duì)不同組別ALT均值分析說(shuō)明，HBV/HCV檢出與一定范圍內(nèi)的ALT水平并無(wú)嚴(yán)格的關(guān)聯(lián)性，如何設(shè)定更合理的獻(xiàn)血人群ALT檢測(cè)限來(lái)體現(xiàn)ALT與HBV/HCV相關(guān)性，需要多中心，大樣本檢測(cè)數(shù)據(jù)的不斷積累和探索。

NAT具有較高的敏感度和特異度，可縮短病毒檢測(cè)的“窗口期”，能有效檢出隱匿性乙肝病毒感染（occulthepatitis B virus infection，OBI）。OBI是一種特殊的HBV感染形式，基本特征為血清HBsAg陰性而肝細(xì)胞/血清HBV DNA 陽(yáng)性，通常血清中HBV DNA 滴度≤200 IU/ml[8]。ALT單項(xiàng)異常標(biāo)本可檢出HBV DNA，說(shuō)明HBV感染者ALT水平異常出現(xiàn)的時(shí)間可能早于HBsAg陽(yáng)轉(zhuǎn)時(shí)間；而酶免和ALT檢測(cè)均合格的血液標(biāo)本可檢出HBV DNA，說(shuō)明HBV DNA的出現(xiàn)早于ALT水平異常時(shí)間?？梢?jiàn)NAT已能發(fā)現(xiàn)HBV前期感染或者OBI，絕大多數(shù)ALT水平異常者被誤排除。

OCI是一種特殊的HCV感染形式，僅能在患者肝組織和/或外周血淋巴細(xì)胞中檢測(cè)到HCV RNA，而血漿/血清中HCV RNA陰性[9]。OHCV具有HCV相似的傳染性[10]，可能與肝臟壞死性炎性活動(dòng)及纖維化相關(guān)[5]。采供血機(jī)構(gòu)現(xiàn)行的ELISA和NAT技術(shù)并不能檢出OCI，是輸血安全面臨的潛在風(fēng)險(xiǎn)。由于OCI可表現(xiàn)為抗-HCV陰性、血清 HCV RNA 陰性、僅肝功能異常的臨床狀態(tài)[11]，ALT水平異常對(duì)OCI檢出可能有一定的輔助作用。本研究在ALT單項(xiàng)不合格獻(xiàn)血者PBMCs中檢出OCI，合格獻(xiàn)血者未檢出OCI，一定程度上證明了ALT對(duì)OCI的篩查作用。

綜上所述，在酶免和NAT雙重檢測(cè)制度普及下，ALT篩查OBI，HBV，HCV及其窗口期的意義并不大。然而，由于ALT初篩不合格獻(xiàn)血者HBV/HCV感染率遠(yuǎn)高于初篩合格者，ALT對(duì)OCI具有一定的篩查作用，對(duì)其他已知或未知肝炎病毒乃至肝臟疾病可能具有一定的輔助診斷作用，目前簡(jiǎn)單取消獻(xiàn)血者ALT這一經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的篩查方法并不合適。如何在減少血液浪費(fèi)和保障血液安全之間取得理想平衡是值得每一個(gè)采供血機(jī)構(gòu)認(rèn)真思考并不斷探討的命題。