歐陽(yáng)春，韓 振，葉小強(qiáng)，黃 磊

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院心血管外科，廣東深圳 518036）

冠狀動(dòng)脈性心臟?。╟oronary heart disease，CHD）是臨床動(dòng)脈粥樣硬化中常見(jiàn)的心血管性疾病之一，主要為冠狀動(dòng)脈發(fā)生粥樣硬化或血管痙攣導(dǎo)致血管腔狹窄或阻塞，導(dǎo)致心肌暫時(shí)性缺血缺氧或心肌梗死的心血管疾病[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)[2]，在我國(guó)15歲以上人群中，冠心病在城市、農(nóng)村及城鄉(xiāng)結(jié)合地區(qū)的患病率分別為1.2%，0.8%和1%，且因冠心病死亡患者所占比例在所有心血管疾病中約為37%。有研究表明[3-5]，大部分冠心病患者具有明顯的家族遺傳病史，發(fā)病具有家族聚集性的特點(diǎn)，其中三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ATP binding cassette subfamily A member 1，ABCA1）對(duì)機(jī)體膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)和高密度脂蛋白的形成發(fā)揮重要作用，而編碼該蛋白的基因與冠心病的發(fā)病具有密切關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，脂肪酸結(jié)合蛋白3（fatty acid binding proteins 3，F(xiàn)ABP3）作為一種主要存在于心肌細(xì)胞中的蛋白，在缺血、缺氧時(shí)可迅速釋放入血，可作為心肌梗死的一種重要標(biāo)志物。但目前，對(duì)ABCA1基因多態(tài)性聯(lián)合FABP3對(duì)于預(yù)測(cè)多支血管病變的穩(wěn)定期冠心病尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬初步探討ABCA1基因多態(tài)性聯(lián)合FABP3對(duì)冠狀動(dòng)脈多支血管病變的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2018年11月～2019年11月期間在我院心內(nèi)科住院治療的237例冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者作為研究對(duì)象，根據(jù)患者冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果，按照病變血管支數(shù)，將患者分為單支病變組（n=101）和多支病變組（n=136）。入選標(biāo)準(zhǔn)：①患者診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)制定的《穩(wěn)定性冠心病診斷與治療指南》，且冠狀動(dòng)脈狹窄診斷的影像學(xué)檢查明確，即存在主要冠狀動(dòng)脈、右冠狀動(dòng)脈及其粗大分支中至少有一支血管管腔的狹窄程度≥70%；②患者年齡≥18周歲，男女不限，自愿參與本研究并簽訂知情同意書(shū)；③患者住院期間臨床資料準(zhǔn)確完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者伴有嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病如肝腎功能障礙性疾病、慢性心力衰竭或惡性腫瘤疾病等；②患者并發(fā)有精神性疾病病史。

1.2 試劑與儀器 本研究所涉及的主要試劑有DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；血清FABP3檢測(cè)試劑盒（上?？道噬锟萍加邢薰荆画傊?，三羥甲基氨基甲烷（美國(guó)Promega公司）；硼酸，純凈水（生工生物工程上海股份有限公司）；SAP緩沖液（上海聯(lián)邁生物工程有限公司）。使用的主要儀器有微量分光光度計(jì)（北京凱奧科技發(fā)展有限公司）；高壓電泳儀（君意東方電泳設(shè)備有限公司）；電子分析天平（上海皓拂儀器儀表有限公司）；臺(tái)式離心機(jī)（上海醫(yī)用分析儀器廠）。

1.3 研究方法

1.3.1 ABCA1基因測(cè)序

1.3.1.1 ABCA1基因突變位點(diǎn)的選擇：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)可能與冠心病相關(guān)的ABCA1基因4個(gè)常見(jiàn)突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，突變位點(diǎn)信息詳見(jiàn)表1。

1.3.1.2 基因組DNA的提?。翰捎帽本┨旄萍加邢薰旧a(chǎn)的血液基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）對(duì)入組患者的血樣進(jìn)行DNA提取。

表1 ABCA1基因4個(gè)突變位點(diǎn)信息

1.3.1.3 DNA含量和純度檢測(cè)：使用北京凱奧科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的K5600超微量分光光度計(jì)分別檢測(cè)260nm和280nm兩處波長(zhǎng)下DNA樣品的吸光度值，對(duì)DNA含量檢測(cè)。DNA樣品濃度采用Lambert-Beer定律進(jìn)行計(jì)算，采用A260mm/A280mm比值評(píng)價(jià)DNA樣品純度。

1.3.1.4 引物設(shè)計(jì)：見(jiàn)表2。采用Assay design3.1軟件設(shè)計(jì)上述4個(gè)位點(diǎn)在聚合酶鏈反應(yīng)所需的引物。

表2 4個(gè)突變位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)

1.3.2 Hard-Weinberg平衡檢驗(yàn)：為考察研究樣本是否具有良好的代表性，對(duì)兩組患者ABCA1基因4個(gè)突變位點(diǎn)發(fā)生頻率采用卡方檢驗(yàn)判斷是否符合Hard-Weinberg平衡，若P值大于0.05，則認(rèn)為該研究群體處于Hard-Weinberg平衡狀態(tài)。

1.3.3 FABP3等生化指標(biāo)檢測(cè)：采用雙抗體夾心ELISA法，使用FABP3檢測(cè)試劑盒（上?？道噬锟萍加邢薰?，中國(guó)）檢測(cè)血清FABP3水平。采用全自動(dòng)生化分析儀（ADVIA2400，西門(mén)子醫(yī)療系統(tǒng)有限公司，德國(guó)）檢測(cè)患者總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）及空腹血葡萄糖（fasting blood glucose，F(xiàn)PG）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究中采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分比表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)定為0.05，即當(dāng)P＜0.05時(shí)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般臨床資料比較 見(jiàn)表2。本研究共納入237例冠狀粥樣硬化性心臟病患者，根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影檢查結(jié)果，單支病變患者101例（42.6%），多支病變患者136例（57.4%）。兩組間在性別、年齡、體重指數(shù)（body mass index，BMI），TC，TG，HDL-C及LDL-C等指標(biāo)上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多支病變組FABP3水平高于單支病變組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 單支病變組和多支病變組患者一般情況比較

2.2 Hard-Weinberg平衡檢驗(yàn) 見(jiàn)表3。采用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)對(duì)單支病變組和多支病變組患者的ABCA1基因4個(gè)位點(diǎn)的基因型分布進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，兩組患者4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率分布符合Hard-Weinberg平衡（P＞0.05），因此，可以認(rèn)為本次研究對(duì)象的群體代表性較好。

表3 Hard-Weinberg平衡檢驗(yàn)

2.3 ABCA1基因突變頻率比較分析 見(jiàn)表4。對(duì)兩組患者ABCA1基因的4個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，單支病變組和多支病變組中僅rs363717突變位點(diǎn)基因型和等位基因頻數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 兩組患者FABP3水平比較 采用t檢驗(yàn)對(duì)兩組患者FABP3水平進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多支病變組患者FABP3水平（2 946.53±453.59pg/ml）高于單支病變組患者（2 249.50±603.21pg/ml），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 ABCA1基因4個(gè)位點(diǎn)的基因型和等位基因頻數(shù)分布比較[n（%）]

2.5 Logistic回歸分析結(jié)果 見(jiàn)表5。對(duì)患者ABCA1基因rs363717位點(diǎn)及FABP3水平進(jìn)行Logistic回歸分析。結(jié)果表明，高水平FABP3（OR=1.003，95%CI：1.002～1.003）是冠心病患者發(fā)生多支血管病變的主要危險(xiǎn)因素，而ABCA1基因rs363717位點(diǎn)突變（OR=0.511，95%CI：0.296～0.884）則是冠心病患者發(fā)生多支血管病變的保護(hù)性因素，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

表5 Logistic回歸分析結(jié)果

2.6 FABP3及rs363717位點(diǎn)突變對(duì)冠狀動(dòng)脈多支血管病變的預(yù)測(cè)價(jià)值 見(jiàn)圖1，表6。ROC曲線(xiàn)顯示，F(xiàn)ABP3曲線(xiàn)下面積（AUC）為0.518 (95% CI：0.439～0.596，P=0.642)，經(jīng)計(jì)算最佳臨界值為2 449.1 pg/ml，rs363717位點(diǎn)突變曲線(xiàn)下面積（AUC）為0.854(95% CI：0.805～0.903，P＜0.01)。

表6 FABP3及rs363717位點(diǎn)突變預(yù)測(cè)能力的曲線(xiàn)下面積

圖1 FABP3及 rs363717位點(diǎn)突變預(yù)測(cè)能力的ROC分析曲線(xiàn)

3 討論

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病是一種累及整個(gè)冠狀動(dòng)脈系統(tǒng)的慢性心臟疾病，根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影檢查，臨床中常可按照病變的累及范圍和程度，將其分為單支病變和多支病變[8]。有研究表明[5,9-10]，多支血管病變的冠心病患者中，其冠狀動(dòng)脈血管壁的斑塊負(fù)荷更加嚴(yán)重，疾病的治療和預(yù)后與單支病變患者具有一定差異。因此，如何在治療早期即對(duì)冠心病患者單支和多支病變進(jìn)行預(yù)測(cè)和判斷，對(duì)分析血管病變和冠狀動(dòng)脈血管缺血事件的關(guān)系，選擇恰當(dāng)?shù)闹委熓侄?，最大程度地改善患者預(yù)后具有重要意義。

FABP3主要存在于心肌組織，由132個(gè)氨基酸殘基組成[11]。研究表明[6]，冠心病患者體內(nèi)血清FABP3水平顯著高于健康受試者，其原因是在心肌細(xì)胞發(fā)生缺血、缺氧等損傷時(shí)，F(xiàn)ABP3可通過(guò)受損的細(xì)胞膜大量釋放入血。本研究結(jié)果提示，單支血管病變的冠心病患者FABP3水平顯著低于多支病變患者，這表明FABP3的血清水平可能反映了冠心病患者血管累及范圍和程度。與周夢(mèng)迪等[14]研究結(jié)果類(lèi)似，該研究顯示患者血清中FABP3水平隨著冠狀動(dòng)脈病變范圍和累及支數(shù)的增加而升高，因此認(rèn)為FABP3血清水平與心肌梗死患者冠狀動(dòng)脈病變的嚴(yán)重程度和累及范圍呈正相關(guān)。分析其機(jī)制可能與下列因素有關(guān)：①影響心肌細(xì)胞的能量代謝。FABP3可為細(xì)胞提供能量，參與到心肌脂肪酸的能量代謝過(guò)程中，當(dāng)FABP3基因表達(dá)被抑制時(shí)心肌細(xì)胞內(nèi)ATP合成顯著減少[13]；②FABP3可減輕機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。當(dāng)心肌細(xì)胞由于長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)缺血、缺氧可引起長(zhǎng)鏈脂肪酸和乙酰輔酶A等產(chǎn)生氧自由基的物質(zhì)聚集，加重心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激，而FABP3具有清除氧自由基的功能，可通過(guò)減少心肌細(xì)胞膜受脂質(zhì)等衍生物的毒性作用達(dá)到減少氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用[14]；③FABP3與細(xì)胞凋亡有關(guān)。有研究表明[12]，抑制FABP3基因表達(dá)可誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡。根據(jù)以上情況推斷，當(dāng)冠心病患者冠狀動(dòng)脈病變支數(shù)增加，血管狹窄程度更重時(shí)，心肌細(xì)胞缺血缺氧的數(shù)量不斷增加，從而進(jìn)一步加重氧化應(yīng)激反應(yīng)，影響能量代謝，導(dǎo)致FABP3釋放入血，使其在血清中水平迅速升高。

ABCA1在體內(nèi)主要參與體內(nèi)HDL-C的形成以及膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，對(duì)降低血液中膽固醇起到促進(jìn)作用[15]。有研究表明[16]，ABCA1基因多態(tài)性與冠心病的發(fā)生具有一定關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，單支病變組rs363717位點(diǎn)野生型患者顯著低于多支病變組，而雜合突變的患者則高于多支病變組，這提示rs363717多態(tài)性位點(diǎn)的A等位基因很可能是冠心病的致病因素。位于3’UTR非編碼區(qū)的rs363717突變位點(diǎn)發(fā)生堿基突變后可導(dǎo)致ABCA1基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而影響mRNA的穩(wěn)定性，并對(duì)mRN和miRNA的相互作用產(chǎn)生影響。有研究表明[17]，ABCA1基因rs363717位點(diǎn)突變降低冠心病的易感性可能是通過(guò)阻礙mRNA和miRNA互補(bǔ)結(jié)合并增加mRNA的穩(wěn)定性而發(fā)揮作用。與我國(guó)學(xué)者楊博[18]的研究結(jié)果類(lèi)似，該研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)rs363717位點(diǎn)的等位基因A突變?yōu)镚時(shí)，冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低，從而認(rèn)為等位基因G是冠心病的保護(hù)因素。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)單支病變組和多支病變組患者在FABP3水平和ABCA1基因rs363717基因位點(diǎn)突變上具有顯著性差異。FABP3水平升高以及ABCA1基因rs363717基因位點(diǎn)為AA的患者是發(fā)生多支血管病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，對(duì)預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈多支血管病變具有一定臨床價(jià)值，但由于樣本量有限，還需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究證實(shí)。