劉杰 張文天 杜錦波

[摘要] 目的 探究結(jié)腸癌組織中微小RNA（miR）-21和肝細胞生長因子受體（C-met）的表達情況及臨床意義。方法 回顧性分析2017年2月～2019年5月河北省滄州市人民醫(yī)院收治的95例結(jié)腸癌患者的病理及臨床資料。通過熒光實時定量PCR技術(shù)定量檢測miR-21和C-met在結(jié)腸癌組織及其癌旁正常組織中的表達量并比較分析其與臨床病理的聯(lián)系，分析癌組織中miR-21和C-met的相關(guān)性。 結(jié)果 結(jié)腸癌組織中miR-21和C-met的表達量均高于對應癌旁正常組織（P < 0.05）。結(jié)腸癌組織中miR-21和C-met的表達與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓有關(guān)（P < 0.05）。結(jié)腸癌組織中miR-21的表達量和C-met的表達量呈顯著正相關(guān)（r = 0.832，P = 0.000）。 結(jié)論 結(jié)腸癌組織中C-met和miR-21的表達均上調(diào)，且與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓有關(guān)，二者均可能成為評估病情嚴重程度及預后情況的潛在標志物。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)腸癌;微小RNA-21;肝細胞生長因子受體;相關(guān)性

[中圖分類號] R735? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）06（b）-0121-04

Expression and clinical significance of miR-21 and C-met in colon cancer

LIU Jie? ?ZHANG Wentian? ?DU Jinbo

Department of Gastrointestinal Surgery， Cangzhou People′s Hospital， Hebei Province， Cangzhou? ?061000， China

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of microRNA（miR）-21 and hepatocyte growth factor receptor（C-met） in colon cancer tissues. Methods The pathological and clinical data of 95 cases with colon cancer who admitted to Cangzhou People′s Hospital of Hebei Province from February 2017 to May 2019 were analyzed retrospectively. Quantitative real-time PCR was used to quantitatively detect the expression levels of miR-21 and C-met in colon cancer tissues and adjacent normal tissues， and their correlation with clinicopathology were analyzed， and the correlation between miR-21 and C-met in cancer tissues was analyzed. Results The expressions of miR-21 and C-met in colon cancer tissues were higher than those in adjacent normal tissues （P < 0.05）. The expressions of miR-21 and C-met in colon cancer tissues were related to TNM stage， lymph node metastasis and vascular cancer embolus （P < 0.05）. There was a significant positive correlation between miR-21 expression and C-met expression in colon cancer tissues （r = 0.832， P = 0.000 ）. Conclusion The expressions of C-met and miR-21 in colon cancer tissues are both up-regulated， and are associated with TNM stage， lymph node metastasis and vascular cancer embolus， which may be potential markers for assessing the severity of the disease and prognosis.

[Key words] Colon cancer; MicroRNA-21; Hepatocyte growth factor receptor; Correlation

結(jié)腸癌是常見的腸道惡性腫瘤，其在發(fā)展中國家的發(fā)病率逐年增加，嚴重危害人們的生活質(zhì)量及生命安全。由于結(jié)腸癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時腫瘤已進展到中晚期[1]，因此深入探尋結(jié)腸癌發(fā)生和進展機制，明確癌變過程中的關(guān)鍵靶點對早期診斷和靶向藥物研發(fā)意義重大。微小RNA（miRNA）是一種內(nèi)源性非編碼RNA，能夠調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后表達、組織分化以及細胞周期等生命活動[2]。miR-21位于染色體17q23.1，其作用類似于原癌基因，通過參與調(diào)控細胞周期和基因表達等過程促進惡性腫瘤進展[3]。相關(guān)研究報道[4]，miR-21能夠抑制細胞凋亡和調(diào)控Ras/MEK/ERK途徑，進而促進癌癥的發(fā)生與進展。肝細胞生長因子受體（C-met）是由原癌基因編碼生成的跨膜蛋白，能夠調(diào)控細胞骨架重排及信息傳導途徑，在癌細胞增殖、分化、浸潤及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[5]。既往研究顯示[6]，C-met蛋白可激活酪氨酸激酶，進而影響信號傳導通路及其酶促反應，與多種癌基因產(chǎn)物關(guān)系密切，在腫瘤細胞中異常表達。本研究探討miR-21和C-met在結(jié)腸癌組織中的表達量及臨床意義，同時分析二者的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2017年2月～2019年5月河北省滄州市人民醫(yī)院收治的95例結(jié)腸癌患者的病理及臨床資料。納入標準：①符合《結(jié)腸癌規(guī)范化診療指南（試行）》[7]標準且結(jié)腸鏡及術(shù)后病理診斷為結(jié)腸癌;②患者臨床資料齊全，且自愿配合本研究;③均為首次診斷，且既往無放化療史和腸道手術(shù)史。排除標準：①合并腸道惡性腫瘤或嚴重疾病者;②伴有肝腎功能嚴重下降而不宜手術(shù)者;③患有先天遺傳性疾病或免疫系統(tǒng)異常者。

本研究共納入研究對象95例，其中男51例，女44例;平均年齡（57.34±9.61）歲;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者14例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者81例;腫瘤直徑≤5 cm者47例，腫瘤直徑>5 cm者48例;高分化者65例，中分化者23例，低分化者7例;TNMⅠ期31例，Ⅱ期44例，Ⅲ期15例，Ⅳ期5例;有脈管癌栓者16例，無脈管癌栓者79例;有遠處轉(zhuǎn)移者19例，無遠處轉(zhuǎn)移者76例。

1.2 方法

miR-21和C-met的表達量采用熒光實時定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）進行檢測。術(shù)中分別取結(jié)腸癌組織和對應癌旁正常結(jié)腸組織（距病灶10 cm處），統(tǒng)一暫存于液氮中，術(shù)后立即轉(zhuǎn)存于-80℃冰箱中。腫瘤直徑通過卡尺測得。兩種組織均取100 mg，研磨后均加入1 mL Trizol試劑（購自Invitrogen公司，生產(chǎn)批號：20161001）提取總RNA。將20 μg總RNA通過ImProm-ⅡTM Reverse Transcriptase（購自Promega 公司，生產(chǎn)批號：20170122）反轉(zhuǎn)錄為cDNA。miR-21和C-met的表達量通過SYBR ExTaq Mix試劑盒（購自TaKaRa 公司，生產(chǎn)批號：20161213）定量檢測。miR-21和C-met的反應條件均為42℃ 60 min，70℃ 15 min。二者PCR反應體系為10 μL SYBR ExTaq Mix、0.4 μL PCR Forward Primer、0.4 μL PCR Reverse Primer、0.4 μL ROX Reference DyeⅡ、2.0 μL cDNA template以及6.8 μL RNase free dH2O，共計20 μL。miR-21上游引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGA-CTGA-3′、下游引物序列為5′-TGGTGCGTGGAGTC-G-3′，內(nèi)參基因U6的正向引物序列為5′-CTCGCTT-CGGCAGCACA-3′、反向引物序列為5′-AACGCTTA-CGAATTTGCGT-3′;C-met正向引物序列為5′-GAGGCAGTGCAGCATGTAGT-3′、反向引物序列為5′-G-ATGATTCCCTCGGTCAGAA-3′，內(nèi)參基因GAPDH正向引物序列為5′-TCAGTGGTGGACCTGACCTG-3′、反向引物序列為5′-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3′。C-met的PCR反應條件為95℃ 5 min，變性95℃ 10 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 30 s;而miR-21的PCR反應條件為95℃ 10 min，變性95℃ 15 s，退火及延伸60℃ 60 s，二者均為40個循環(huán)，每個樣本均進行3次檢測。所有引物均由上海生工公司負責合成。所有樣品均用相對Ct值法評估，結(jié)果以ΔCt值表示，miR-21和C-met的表達量分別相對于U6和GAPDH的比值為2-ΔΔCt，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗;相關(guān)性檢驗用Pearson相關(guān)分析。以P < 0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織及其對應癌旁正常組織中miR-21和C-met的表達量比較

結(jié)腸癌組織miR-21和C-met表達量均高于對應癌旁正常組織（均P < 0.05）。見表1。

2.2 結(jié)腸癌組織中miR-21和C-met的表達量與臨床病理的關(guān)系

結(jié)腸癌組織中miR-21和C-met的表達量與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓有關(guān)（P < 0.05），與患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度無關(guān)（P > 0.05）。見表2。

2.3 結(jié)腸癌組織中miR-21和C-met表達的相關(guān)性分析

結(jié)腸癌組織中miR-21的表達量和C-met的表達量呈顯著正相關(guān)（r = 0.832，P = 0.000）。見圖1。

3 討論

結(jié)腸癌屬于高度惡性的腸道腫瘤，其發(fā)病率在惡性腫瘤中居第三位，而死亡率居第二位，對人類健康造成巨大威脅[8]。近年來，由于生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病率仍不斷提高，且呈顯著地域性差異[9]。結(jié)腸癌的發(fā)病是一個復雜且漫長的過程，是多因素、多階段及多基因共同作用的結(jié)果，其中以抑癌基因失活和原癌基因激活尤為關(guān)鍵[10]。目前，臨床主要采用手術(shù)為主、化療為輔的治療方式，但由于結(jié)腸癌毗鄰器官較多、周圍血供和淋巴系統(tǒng)豐富，易于遠處轉(zhuǎn)移和侵犯周圍器官，因此療效較差，患者復發(fā)率和死亡率較高。表觀遺傳學是結(jié)腸癌近年來研究的熱點，有望為結(jié)腸癌的早期診斷、預防以及評估預后提供有力證據(jù)。既往研究顯示[11-12]，DNA甲基化、非編碼RNA、組蛋白修飾以及DNA磷酸化均在腫瘤易感性及進展中發(fā)揮重要作用，使環(huán)境介導基因表型改變，進而造成基因表達多樣性，最終提高正常細胞演變?yōu)榘┘毎娘L險。

miRNA是高度保守的非編碼RNA，主要位于內(nèi)含子或基因間隔區(qū)，其表達具有組織和時序特異性。研究顯示[14]，miR-21具有致癌作用，在肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中表達上調(diào)。此外，miR-21通過作用其靶點PDCD4和抑制凋亡蛋白2，促進結(jié)腸癌細胞不斷增殖、分化及侵襲，同時，也有助于提高癌細胞的耐藥性[14]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中miR-21的表達量高于對應癌旁組織（P < 0.05），其機制可能為長鏈非編碼RNA（LncRNA）MEG3能夠負性調(diào)控miR-21的表達有關(guān)。在正常細胞中，LncRNA MEG3自身可以作為分子海綿，通過結(jié)合miR-21抑制其表達，然而在腫瘤細胞中LncRNA MEG3表達下調(diào)，使抑制miR-21的作用減弱，從而使miR-21上調(diào)[15]。結(jié)腸癌組織中miR-21的表達與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓有關(guān)（P < 0.05），且惡性度越高，miR-21表達量越高。其機制可能為癌組織中的miR-21激活PI3K/AKT信號通路，促進癌細胞增殖，抑制其凋亡，調(diào)節(jié)病灶周圍炎性反應，同時誘導正常細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，降低E-鈣黏素，使其分化程度降低并促進轉(zhuǎn)移[16]。miR-21能夠抑制BTG2、NEDD4L以及PDCD4等抑癌基因發(fā)揮作用，且促進原癌基因表達，從而刺激癌細胞分化和增殖[14]。此外，miR-21能夠誘導侵襲因子基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2和MMP-9的表達，增強癌細胞的侵襲和遷移能力，使腫瘤的惡性度增加[16]。

C-met又稱肝細胞生長因子受體，位于細胞膜骨架上，包含兩種亞基（α和β）和一個酪氨酸激酶區(qū)，具有酪氨酸激酶活性[17]。C-met通過結(jié)合肝細胞生長因子（HGF）使自身磷酸化，進而誘導其他底物蛋白磷酸化，激活3-磷脂酰肌醇激酶途徑和有絲分裂原活化蛋白激酶途徑，使HGF活化，促進腫瘤細胞無限增殖及分化[18]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中C-met的表達量高于對應癌旁正常組織（P < 0.05）。其機制可能為癌組織中過度表達的HGF結(jié)合C-met，激活酪氨酸激酶，使其催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)的酪氨酸酶（Tyr）1234和Tyr1235發(fā)生磷酸化反應，進而增加C-met的生物活性，使C-met表達提高[19]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中C-met的表達與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓有關(guān)（P < 0.05），且惡性度越高，C-met表達量越高。其原因可能是活化的C-met能夠激活黏附分子并重排細胞骨架結(jié)構(gòu)，同時，MMP被激活，從而降解部分細胞外基質(zhì)，促進癌細胞向周圍組織的浸潤和轉(zhuǎn)移[20-21]。同時，C-met通過自體磷酸化促進磷脂酶、Ras蛋白以及接頭蛋白Gab1等蛋白的酪氨酸磷酸化，逐步形成級聯(lián)化的磷酸化反應，將放大的信號轉(zhuǎn)導入細胞核的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，從而使癌細胞增殖和分化能力增強[17]。

本研究結(jié)果顯示，癌組織中的C-met表達量和miR-21表達量呈顯著正相關(guān)（P < 0.05），提示C-met和miR-21可能都具有促進癌癥進展的功能，且miR-21可能與C-met互為協(xié)同作用，共同加速結(jié)腸癌的發(fā)生及進展。盡管目前無研究顯示二者作用的具體機制，但C-met和miR-21均可作用于RAS/ERK信號通路，增強癌細胞的活性，促進腫瘤進展，間接反映了二者可能通過該信號通路起到互相協(xié)同的作用[4，17]。然而，本研究樣本量有限，C-met和miR-21之間的作用機制仍不明確，需要進一步探索。

綜上所述，結(jié)腸癌組織中C-met和miR-21的表達均上調(diào)，且與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓有關(guān)，可能是評估病情嚴重程度及預后情況的潛在標志物。

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（收稿日期：2019-11-13? 本文編輯：劉明玉）