徐彩娜 石亞志 武桂平

腦缺血是一種常見的急性腦血管病，臨床表現為突然發(fā)作的頭暈、眼花、耳鳴，嚴重時出現單側或雙側肢體無力、意識模糊、復視甚至雙目失明[1-2]。海馬是腦內對缺血較為敏感的部位之一，腦缺血會引起海馬缺血損傷導致神經元功能障礙[3]。腦紅蛋白(NGB)是一種在神經系統(tǒng)特異高表達的六配位血紅素單體球蛋白，也是一種神經元損傷修復介質，可促進神經突起生長和分支，減輕神經元損傷[4]。相關研究發(fā)現，NGB能促進大鼠急性脊髓損傷后傷區(qū)軸突再生[5]，然而其對大鼠腦缺血性神經損傷后受損神經元軸突生長能力的調控作用機制尚不明確。因此，本研究對大鼠腦缺血性神經損傷后NGB對受損神經元軸突再生能力的調控作用及機制進行探討，以期為腦缺血性神經損傷的研究提供新思路。

材料與方法

1.材料：無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠30只，體質量(280±20)g，購自上海茂生衍生物科技有限公司，生產許可SCXK(滬)2017-0004。

2.方法

(1)分組及造模：將30只大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后隨機分為假手術組、模型組、Hemin組，每組10只。造模方法：采用雙側頸總動脈結扎的方法制備腦缺血模型。大鼠術前禁食12 h，腹腔注射0.3 mg/kg 10%水合氯醛(陜西圣瑞醫(yī)藥科技有限公司)麻醉后固定在手術臺上，用毛剪剪短頸部正中被毛，碘伏消毒剪毛區(qū)，在其頸部做一長1.5～2.0 cm的正中切口，止血鉗鈍性分離皮下筋膜組織，暴露氣管周圍肌肉，在外科手術顯微鏡(武漢科爾達醫(yī)療科技有限公司)下找到左右兩側頸總動脈并分離結扎，消毒手術傷口周圍皮膚后縫合皮膚切口，將大鼠置于鼠籠中待其蘇醒，對大鼠進行神經功能評分，1～4分視為造模成功，剔除造模失敗及死亡大鼠，并隨機補充。假手術組大鼠僅暴露雙側頸總動脈但不穿線結扎。Hemin組大鼠于術后第1天腹腔注射50 mg/kg NGB誘導劑Hemin，每天1次。

(2)神經功能評定：2周后參照Zea-longa標準[5]對大鼠進行神經功能評定：不能自發(fā)行走且有意識障礙為4分；行走時向左側傾倒為3分；行走時向左側轉圈為2分；不能完全伸展左側前爪為1分；無神經功能缺損為0分。

(3)蘇木素-伊紅(HE)染色:神經功能評定結束后處死大鼠，取其腦組織，用10%甲醛溶液(上海譜振生物科技有限公司)固定，梯度酒精(南京森貝伽生物科技有限公司)脫水，二甲苯(深圳宏正興科技有限公司)透明，石蠟包埋成塊，用組織切片機(湖北孝感闊海醫(yī)療科技有限公司)5μm厚連續(xù)切片，脫蠟，脫水，蘇木素(上海江萊生物科技有限公司)染色，流水沖洗，1%鹽酸溶液(上海雅吉生物科技有限公司)分化數秒，流水沖洗，伊紅(上海江萊生物科技有限公司)染色，脫水，透明，中性樹膠(上海羽朵生物科技有限公司)封片，采用顯微鏡(蘇州技高電子科技有限公司)觀察HE染色結果。

(4)蛋白質免疫印跡法(Western blot):取各組大鼠腦組織，剪碎后置于玻璃勻漿器中，加入組織裂解液(北京天恩澤基因科技有限公司)，勻漿，13 000 r/min離心15 min，取上清液，使用BCA試劑盒(上海荔達生物科技有限公司)測定蛋白濃度并進行定量，取總蛋白上樣，電泳，切膠，轉膜，5%脫脂奶粉封閉液(廣州輝駿生物科技有限公司)封閉，加入1∶1 000稀釋的兔抗生長相關蛋白-43(GAP-43)單克隆抗體(上海晅科生物科技有限公司)、1∶500稀釋的鼠抗神經絲-200(NF-200)單克隆抗體(上海研生生化試劑有限公司)、1∶500稀釋的兔抗NGB單克隆抗體(天津卡梅德生物科技有限公司)、1∶300稀釋的兔抗磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)單克隆抗體(杭州華安生物技術有限公司)、1∶200稀釋的兔抗磷酸化蛋白激酶B(P-AKT)單克隆抗體(上海田源生物技術有限公司)、1∶500稀釋的兔抗甘油三磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(杭州華安生物技術有限公司)，4 ℃孵育過夜，芳香族共聚酯洗滌緩沖液(PBST)洗膜，加入1∶4 000稀釋的山羊抗小鼠IgG(杭州納晶科技有限公司)，于37 ℃孵育60 min，PBST洗膜，將膜與超敏電化學發(fā)光(ECL)試劑的化學發(fā)光底物反應，暗室曝光、顯影，將X光膠片用掃描儀(杭州梅清數碼科技有限公司)掃描后使用美國Image J軟件分析各條帶灰度值，以GAPDH為內參蛋白，分析各目標蛋白表達量。

結 果

1.3組大鼠神經功能評分比較：模型組、Hemin組和假手術組大鼠神經功能評分分別(3.02±0.81)分、(2.11±0.48)分和0分，3組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=266.158，P<0.001)。Hemin組大鼠神經功能評分明顯高于假手術組，且明顯低于模型組(P<0.05)。

2.3組大鼠海馬CA1區(qū)細胞形態(tài)學比較：假手術組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞形態(tài)正常，無核固縮現象，未見水腫，細胞分布比較均勻，胞體形態(tài)正常，其橫截面呈圓形，胞漿染色均勻。模型組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞形態(tài)異常，出現明顯核固縮現象，可見明顯水腫，細胞分布散亂不均，胞體形態(tài)異常難以分辨，胞漿染色不均，尼氏小體淡染、數量減少，神經突觸數量減少、消失，空泡細胞增多。Hemin組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞形態(tài)及分布趨于正常，胞漿染色較均勻，核固縮現象及水腫較模型組明顯減少，尼氏小體深染、數量增多，神經突觸數量增多，空泡細胞減少。見圖1。

注：A:假手術組；B：模型組；C：Hemin組;白色箭頭表示正常的錐體細胞，黑色箭頭表示固縮的錐體細胞圖1 3組大鼠海馬CA1區(qū)細胞形態(tài)學觀察(HE染色，×400)

3.3組大鼠腦組織中NGB蛋白表達量比較：模型組、Hemin組大鼠腦組織中NGB蛋白表達量明顯高于假手術組(P<0.05)，且Hemin組明顯高于模型組(P<0.05)。見圖2、表1。

圖2 3組大鼠腦組織中NGB蛋白表達

表1 3組大鼠腦組織中NGB蛋白表達量比較

4.3組大鼠腦組織中NF-200、GAP-43蛋白表達量比較：模型組、Hemin組大鼠腦組織中NF-200、GAP-43蛋白表達量明顯高于假手術組(P<0.05)，且Hemin組明顯高于模型組(P<0.05)。見圖3、表2。

表2 3組大鼠腦組織中NF-200、GAP-43蛋白表達量比較

圖3 3組大鼠腦組織中NF-200、GAP-43蛋白表達

5.3組大鼠腦組織中PI3K/AKT信號通路蛋白變化：模型組大鼠腦組織中PI3K、P-AKT蛋白表達量明顯低于假手術組(P<0.05)，Hemin組大鼠腦組織中PI3K、P-AKT蛋白表達量明顯高于模型組(P<0.05)，Hemin組明顯低于假手術組(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 3組大鼠腦組織中PI3K/AKT信號通路蛋白變化

表3 3組大鼠腦組織中PI3K/AKT信號通路蛋白變化

討 論

目前，關于腦缺血對海馬神經元影響的研究很多。有研究發(fā)現，腦缺血可導致海馬形態(tài)、結構及功能改變[6]。有研究結果顯示，大鼠腦缺血后神經功能評分升高，腦梗死面積增加[7]。Che等[8]通過動物實驗發(fā)現，大鼠在腦缺血15 min后可見海馬CA1區(qū)的θ節(jié)律的振幅下降，且該區(qū)域錐體細胞形態(tài)異常，細胞骨架遭到破壞，神經突觸密度降低，超微結構發(fā)生改變，出現明顯水腫及核固縮現象。本研究結果與既往研究結果一致，提示大鼠腦缺血后易造成神經元損傷[7-8]。此外有文獻報道，腦缺血還可引起海馬內細胞因子改變，如NF-200、GAP-43等[9]。GAP-43是一種快速轉運胞膜磷酸蛋白，由神經元胞體合成，在損傷后神經元胞體和出芽再生神經軸突中高度表達，參與快速軸索運輸、神經軸突生長及修復[10]。NF-200是一種構成神經胞體及軸突骨骼框架的結構蛋白，在維持神經元細胞形態(tài)及軸突運輸中具有重要作用，能較好地反映神經軸突損傷和修復情況，間接提示軸突再生狀況[11]。腦缺血損傷發(fā)生后，NF-200在缺血損傷周邊區(qū)神經軸突合成增加，以適應神經再生的需要[12]。因此，本研究將NF-200、GAP-43蛋白作為神經元軸突再生的標志性蛋白，結果顯示模型組大鼠腦組織中NF-200、GAP-43蛋白表達量明顯高于假手術組，說明腦缺血神經損傷后存在神經元軸突再生。

NGB是一種內源性神經保護分子，是血紅素蛋白(HP)家族新成員，主要表達于代謝、耗氧劇烈的脊椎動物神經細胞中，在腦缺血缺氧、毒物損傷、氧化應激(OS)等病理情況下，NGB的表達均有不同程度的增加，其與氧具有高度親和力，可通過協助氧轉運、清除自由基、與細胞色素C(CYC)相互作用等多種途徑增強組織對缺血性損傷的耐受，從而發(fā)揮對腦缺血損傷的保護作用[13]。Hemin即氯化高鐵血紅素，可誘導神經細胞NGB高表達，為NGB的誘導劑[14]。Tao等[15]通過體外培養(yǎng)神經細胞發(fā)現，NGB誘導劑Hemin濃度升高可減少神經元損傷。本研究結果顯示，給予NGB誘導劑Hemin干預后，Hemin組大鼠的神經功能評分、大鼠海馬CA1區(qū)細胞病理損傷程度較模型組明顯下降，大鼠腦組織中NGB、NF-200、GAP-43蛋白表達量較模型組明顯升高，說明NGB能夠促進大鼠腦缺血性神經損傷后神經元大量合成NF-200、GAP-43，從而加速神經元軸突再生，促進神經組織損傷的修復。但目前NGB作為內源性神經保護因子改善神經功能的機制尚不清楚，有研究認為，大鼠腦缺血性損傷后NGB對受損神經元軸突再生的改善作用與PI3K/Akt信號通路有關[16]，這與本研究結果一致。本研究結果顯示，Hemin組大鼠腦組織中PI3K、P-AKT蛋白表達量明顯高于模型組，其原因可能是PI3K導致了下游直接靶蛋白AKT的磷酸化，P-AKT進一步誘導下游效應分子的激活，導致細胞存活信號通路PI3K/AKT的激活，從而促進受損神經細胞再生。因此，本研究從分子水平進一步表明了PI3K/Akt信號通路可能介導了NGB對腦缺血性神經損傷的保護作用。

綜上所述，NGB可能通過調控PI3K/AKT信號轉導通路上調大鼠腦缺血性神經損傷后神經元生長相關蛋白NF-200、GAP-43表達，以促進受損神經元軸突再生，從而發(fā)揮對腦缺血性神經損傷的改善作用。