孫強，尉希清，張洪生，胡玲愛，宋秉春，張延春，張金國

絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是信號從細胞膜向細胞核傳遞的重要中介，在維持細胞生長、發(fā)育及凋亡等一系列行為和功能中發(fā)揮重要作用。近來研究[1-2]表明，高糖刺激能使氧化應激增強，生長因子及細胞因子表達增加，而這些變化可激活MAPK 家族，使其轉錄活性增強，參與糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生。已有研究[3]表明，辛伐他汀對糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化具有保護作用，但其具體作用機制、對還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶-p38MAPK 通路的影響，目前尚少見報道。本實驗通過建立高糖誘導乳鼠心肌細胞損傷模型，觀察辛伐他汀對高糖損傷乳鼠心肌細胞NADPH 氧化酶-p38MAPK 信號通路及心肌細胞凋亡的影響，探討辛伐他汀對高糖損傷心肌細胞的保護作用及其分子機制。

1 材料與方法

實驗動物:新生1～3d 齡SD 大鼠，由蘇州大學實驗動物中心提供。實驗大鼠的使用嚴格遵守動物實驗的各項倫理條例。

藥品及主要試劑：胎牛血清、改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM 培養(yǎng)基）(Gibco 公司，美國)；辛伐他?。╯imvastatin）原粉（默沙東公司，美國）；牛胰蛋白酶、二甲基亞楓（DMSO）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒（Sigma 公司，美國）；D-葡萄糖（巴斯夫化工有限公司，天津）；免疫沉淀（IP）裂解液、BCA法蛋白定量試劑盒和半胱天冬氨酸蛋白激酶-3（Caspase-3）試劑盒（西唐生物科技有限公司，上海）；乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（建成生物工程研究所，南京）；PCR 引物（上海生工生物工程有限公司，上海）；RNA 逆轉錄試劑盒及PCR 試劑盒（Fermentas公司，美國）；Western blot 試劑盒（KPL 公司，美國）；抗鼠3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）基因內參（Millipore 公司，美國）；抗兔多克隆p38MAPK 抗體；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記測定法（Cell Signaling 公司，美國）；細胞凋亡檢測（TUNEL）試劑盒和抗鼠α-肌動蛋白（α-actin）單克隆抗體（博士德，武漢）。

實驗分組:待培養(yǎng)72 h 心肌細胞生長穩(wěn)定，搏動良好后按隨機化原則分組并加入相應的干預藥物，將心肌細胞隨機分為五組：（1）用含有20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h，不加任何刺激藥物,為對照組；（2）含有20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中加入終濃度為25 mmol/L 的葡萄糖繼續(xù)培養(yǎng)72 h，為高濃度葡萄糖刺激組（高糖組）；（3）三組不同濃度的辛伐他汀干預組即含有20%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中加入終濃度為25 mmol/L 的葡萄糖及終濃度分別為10-7、10-6、10-5mol/L（M）的辛伐他汀繼續(xù)培養(yǎng)72 h，分別為高糖+10-7M 辛伐他汀組、高糖+10-6M 辛伐他汀組、高糖+10-5M 辛伐他汀組。以上各組心肌細胞每個檢測指標均設置六個復孔。

MTT 比色法測定心肌細胞活力:參照劉會等[4]的方法，用MTT 比色法測定心肌細胞活力，各組細胞活力=(各濃度組OD值/對照組OD值)×100%與之比較。

培養(yǎng)液內LDH 活力及SOD 活力測定：嚴格按試劑盒的說明書檢測培養(yǎng)液中LDH 活力和SOD 活力。

逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測心肌細胞內NADPH 氧化酶亞基p22phox、p47phoxmRNA 表達：引物序列如下：p22phox 引物序列：正向引物：5'-CTCTATTGTTGCAGGAGTGC-3'，反向引物:5'-TCACACGACCTCATCTGTCAG-3'，基因片段長度457bp；p47phox 引物序列：正向引物：5'-GCTCACCGAGTACTTCAACA-3'，反向引物：5'-GCCTTCTGCAGATACATG GA-3'，基因片段長度570bp；β-actin 引物序列：正向引物：5'-CACGATGGAGGGG CCGGACTCATC-3'，反向引物：5'-TAAAGACCTC TATGCCAACACAGT-3'，基因片段長度241bp。

Western Blot 檢測各組心肌細胞p38MAPK 蛋白表達：用BCA 法[5]進行蛋白定量，應用1D 凝膠定量軟件（BIO-RAD Quantity One） 4.6.2 軟件對Western 條帶進行半定量分析，以目的條帶光密度/GAPDH 光密度作為表達強度的定量指標,計算各組蛋白的相對表達量。

乳鼠心肌細胞培養(yǎng)液中Caspase-3 濃度測定：Caspase-3 的活化是細胞凋亡的最終共同途徑，可以反映凋亡發(fā)生的程度。采用ABC-Elisa 法測定培養(yǎng)液中Caspase-3 濃度，嚴格按Caspase-3 的試劑盒說明書步驟操作，用芬蘭Thermo 公司Mμltiskan MK3酶標儀測定，單位μmol/L。

TUNEL 免疫熒光染色檢測各組乳鼠心肌細胞凋亡情況：按試劑盒說明書通過免疫熒光染色測各組乳鼠心肌細胞凋亡數(shù)，細胞核被4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染成藍色，凋亡細胞被染成綠色。

2 結果

心肌細胞形態(tài)學觀察：培養(yǎng)72 h 后，臺盼藍染色隨機取3 個視野觀察，細胞存活率分別為98.4 %、97.6% 和97.2%。用α-actin 抗體檢測證明心肌細胞純度較高(圖1）。對照組心肌細胞成簇生長，呈梭形、星形或不規(guī)則三角形，細胞伸出偽足，核呈卵圓形并居中，搏動規(guī)律有力，細胞搏動頻率為60～120 次/min；高糖組心肌細胞皺縮變圓，偽足減少，細胞搏動頻率增快；三組不同濃度的辛伐他汀干預組心肌細胞的生長狀態(tài)較好，細胞形態(tài)明顯好于高糖組，且貼壁細胞多于高糖組；高糖+10-5M 辛伐他汀組的細胞生長狀態(tài)及細胞存活率要好于高糖+10-7M 辛伐他汀組，細胞的搏動頻率明顯慢于高糖組，搏動有力。隨著辛伐他汀濃度的增加，細胞生長狀態(tài)愈好，搏動頻率愈慢。培養(yǎng)的各組心肌細胞形態(tài)見圖2。

辛伐他汀對高糖刺激的心肌細胞活力、LDH 活力及SOD 活力的影響（表1）：與對照組比較，高糖組、高糖+10-7M 辛伐他汀組、高糖+10-6M 辛伐他汀組心肌細胞活力及SOD 活力明顯降低，LDH 活力明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）；高糖+10-5M 辛伐他汀組心肌細胞活力、SOD 活力及LDH活力與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與高糖組比較，三組不同濃度的辛伐他汀干預組心肌細胞活力及SOD 活力明顯升高，LDH 活力明顯降低（P＜0.05），且呈濃度依賴性（P＜0.05）。

圖1 大鼠原代心肌細胞α-actin 免疫熒光鑒定（×20）

圖2 培養(yǎng)的各組乳鼠心肌細胞形態(tài)圖（×40）

表1 各組乳鼠心肌細胞活力、LDH 活力及SOD 活力的比較 (，n=6)

表1 各組乳鼠心肌細胞活力、LDH 活力及SOD 活力的比較 (，n=6)

注：心肌細胞活力=實驗組吸光度值／對照組吸光度值 ×100%（吸光度通過MTT 法測得） 。M 表示mol/L，LDH：乳酸脫氫酶，SOD：超氧化物歧化酶。與對照組比較*P＜0.01；與高糖組比較△P＜0.05；與高糖+10-7M 辛伐他汀組比較▲P＜0.05；與高糖+10-6M 辛伐他汀組比較#P＜0.05

辛伐他汀對高糖刺激乳鼠心肌細胞凋亡的影響：通過TUNEL 染色檢測辛伐他汀對高糖刺激乳鼠心肌細胞凋亡的影響，與對照組相比，高糖組TUNEL 陽性細胞（綠色熒光）顯著增多，辛伐他汀干預后TUNEL 陽性細胞（綠色熒光）顯著減少，且呈劑量依賴性（圖3）。

辛伐他汀對高糖刺激時心肌細胞p38MAPK 蛋白表達的影響（圖4）：與對照組比較，高糖組、高糖+10-7M 辛伐他汀組、高糖+10-6M 辛伐他汀組p38MAPK 蛋白表達顯著升高（P均＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義，其中高糖組p38MAPK 蛋白表達水平達對照組的2.6 倍；高糖+10-5M 辛伐他汀組p38MAPK 蛋白表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與高糖組比較，三組不同濃度的辛伐他汀干預組p38MAPK 蛋白表達顯著下調，抑制率分別為12.3%、23.1%、61.5%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且呈濃度依賴性(P＜0.05）。

辛伐他汀對高糖培養(yǎng)的心肌細胞培養(yǎng)液中Caspase-3 濃度的影響（表2）：與對照組比較，高糖組，高糖+10-7M 辛伐他汀組，高糖+10-6M 辛伐他汀組Caspase-3 濃度顯著升高（P均＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義，高糖+10-5M 辛伐他汀組Caspase-3 濃度與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與高糖組比較，三組不同濃度的辛伐他汀干預組Caspase-3 濃度顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且呈濃度依賴性(P＜0.05)。

辛伐他汀對高糖刺激時心肌細胞NADPH 氧化酶p22phox、p47phox mRNA 表達的影響（圖5）：與對照組比較，高糖組、高糖+10-7M 辛伐他汀組、高糖+10-6M 辛伐他汀組NADPH 氧化酶p22phox、p47phoxmRNA 表達顯著上調（均為P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義；高糖+10-5M 辛伐他汀組NADPH 氧化酶p22phox、p47phoxmRNA 表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與高糖組比較，三組不同濃度的辛伐他汀干預組NADPH 氧化酶p22phox、p47phoxmRNA 表達顯著下調，抑制率分別為21.7%、33.2%、52.2%及14.9%、34.6%、46.6%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且呈濃度依賴性(P＜0.05）。

圖3 TUNEL 染色檢測各組乳鼠心肌細胞的凋亡細胞數(shù) （×10）

圖4 Western blot 分析各組乳鼠心肌細胞p38MAPK 蛋白表達的免疫印跡圖

圖5 辛伐他汀對高糖刺激時各組乳鼠心肌細胞NADPH 氧化酶p22phox、p47phox mRNA 表達的影響

表2 高糖刺激心肌細胞后辛伐他汀對各組乳鼠心肌細胞培養(yǎng)液中Caspase-3 濃度的影響（μmol/L，n=6）

3 討論

糖尿病病變過程中的并發(fā)癥，尤其是心臟方面的并發(fā)癥的發(fā)生機制以及治療已引起廣泛關注，成為研究熱點之一。本實驗通過應用高濃度葡萄糖刺激原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞后，發(fā)現(xiàn)心肌細胞活力明顯下降，培養(yǎng)液中LDH 活力明顯增高，SOD 活力明顯降低，表明高濃度葡萄糖引起心肌細胞發(fā)生損傷。與國內研究[2,6]結果一致。應用辛伐他汀干預后，心肌細胞活力及SOD 活力明顯升高，LDH 活力明顯降低，辛伐他汀抑制了高糖對心肌細胞的氧化損傷。

既往研究表明，糖尿病及其并發(fā)癥 (心血管并發(fā)癥，糖尿病腎病等)伴隨著細胞內NADPH 氧化酶途徑激活，從而發(fā)生氧化應激[7]，p38MAPK 可能在與心肌損傷和心肌重構過程有關的心臟病變時激活[8]。本研究結果表明，高糖刺激使NADPH 氧化酶亞基mRNA 表達上調，p38MAPK 蛋白表達增高，Caspase-3 表達增高，凋亡陽性細胞數(shù)增多，而辛伐他汀干預呈濃度依賴性地使NADPH 氧化酶mRNA表達降低，p38MAPK 表達降低，Caspase-3 濃度降低，凋亡陽性細胞數(shù)減少?；A和臨床資料已經(jīng)表明他汀類藥物能夠通過減輕NADPH 氧化酶源性的活性氧的產(chǎn)生抑制心肌細胞肥大并改善心功能。周超杰等[9]研究表明，激活的JNK 信號通路參與了STZ 誘導的糖尿病心肌病損傷過程,辛伐他汀能夠緩解糖尿病心肌損傷。呂莎莎等[10]研究表明，辛伐他汀降低2 型糖尿病大鼠心肌Toll 樣受體4 表達，均與本實驗結果一致。孫靜等[11]研究結果顯示缺血后適應通過抑制心肌p38MAPK 的磷酸化而減少再灌注過程中血小板-白細胞聚集體的表達,進一步減輕缺血再灌注損傷，與本研究通路一致。Riad 等研究表明，糖尿病大鼠p38MAPK 表達增高，而在心臟特異性表達p38MAPK 負變株的轉基因糖尿病大鼠的心肌細胞形態(tài)和功能明顯改善，p38MAPK 激活是糖尿病心肌病心肌重構必要的通路[8]，抑制p38MAPK可以改善鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病大鼠的心功能和內皮細胞功能。

氧化應激引起心肌細胞的凋亡和壞死在心肌細胞損傷中發(fā)揮重要作用，因為心肌細胞幾乎不具有再生能力，因此凋亡增加引起心肌細胞減少成為糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎。Caspase-3 是凋亡關鍵效應酶，是絕大多數(shù)凋亡機制的必經(jīng)共同途徑，一旦Caspase-3 活化，則凋亡不可逆轉，因此常測定組織Caspase-3 活性反映凋亡程度。本研究行TUNEL 染色結果顯示高糖組凋亡陽性細胞數(shù)明顯增加，測定培養(yǎng)液中Caspase-3 濃度表明高糖引起了明顯的心肌細胞凋亡，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義，這一點與Andrea 等在糖尿病患者的心室肌標本的檢測結果一致，該研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者心肌細胞的凋亡是非糖尿病患者的85 倍，而壞死只有3～4 倍。以往的研究證實在糖尿病患者及STZ誘導的糖尿病大鼠心肌內均發(fā)現(xiàn)增多的凋亡細胞[12]；在體外培養(yǎng)的心肌細胞，給予高糖刺激后，細胞的凋亡指數(shù)明顯增加[13]；Ghosh 等[14]也在STZ 大鼠心肌中發(fā)現(xiàn)Caspase-3 活性增高并伴有心臟收縮舒張功能不全；Ricci 等[15]研究表明，以25 mmol/L 濃度的高糖培養(yǎng)的心肌細胞凋亡明顯增多，均與本研究結果一致。李凡璐[16]研究表明，辛伐他汀抑制糖尿病大鼠心肌細胞p53 和凋亡調控基因（BAX）表達、增加抗凋亡基因（BCL-2）的表達，從而抑制心肌細胞凋亡；Al-Rasheed 等[17]研究表明，辛伐他汀能夠減輕糖尿病大鼠心肌氧化應激和炎癥反應，預防糖尿病大鼠心臟組織學改變和膠原沉積。我們的實驗結果表明辛伐他汀治療后通過抑制NADPH 氧化酶-p38MAPK 通路降低心肌細胞Caspase-3 表達，凋亡陽性細胞數(shù)減少，從而抑制心肌細胞凋亡，對高糖損傷的乳鼠心肌細胞發(fā)揮保護作用。

綜上所述，我們的實驗結果證明高糖-NADPH氧化酶-p38MAPK 通路是高糖損傷心肌細胞的重要機制，并發(fā)現(xiàn)辛伐他汀通過抑制NADPH 氧化酶活性降低p38MAPK 蛋白表達，抑制心肌細胞凋亡。本研究結果不僅為他汀類藥物與糖尿病氧化應激之間的關系拓寬了認識的視野，而且將為利用他汀類藥物作為防治糖尿病慢性并發(fā)癥的藥物臨床應用提供依據(jù)。但是本研究是在細胞水平的研究，而體內存在著龐大的物質聯(lián)系，他汀類藥物在體內條件下的多效性作用和細胞代謝的相互關系以及對糖尿病心肌病的影響還有待于進一步研究和探索。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突