李燕，馮杰，聶宇，王玉瑤

心血管病是威脅人類健康的第一殺手[1]。心肌細(xì)胞作為心臟研究的焦點(diǎn)，長(zhǎng)期以來(lái)被用作心臟生理學(xué)和病理學(xué)的研究工具[2]。雖然商品化的心臟細(xì)胞系，如HL-1 細(xì)胞的獲取及操作更為方便[3]，但體外分離的原代心肌細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上與心臟的生理及病理機(jī)制具有更好的相關(guān)性。因此，掌握心肌細(xì)胞體外分離技術(shù)至關(guān)重要。

隨著年齡增長(zhǎng)，心肌細(xì)胞的形態(tài)及功能均會(huì)發(fā)生很大的變化。在胚胎期及出生后7 d 內(nèi)，心肌細(xì)胞具有增殖能力，隨后這種自我增殖能力喪失[4]。因此，分離不同發(fā)育階段（胚胎期至成年期等）的心肌細(xì)胞可為再生醫(yī)學(xué)以及臨床治療提供強(qiáng)有力的支撐條件。

針對(duì)胚胎期或某一特定年齡段小鼠的心肌細(xì)胞體外分離方法已多較有相關(guān)報(bào)道[5-6]。但目前鮮有研究系統(tǒng)性、比較性地分析胚胎期及出生后不同年齡段小鼠心肌細(xì)胞的體外分離方法。本研究將系統(tǒng)性、比較性地分析胚胎期及出生后不同年齡段小鼠心肌細(xì)胞體外分離的各種方法，并對(duì)其進(jìn)行條件優(yōu)化，以期得到不同年齡段小鼠心肌細(xì)胞分離的最佳方法，從而獲得純度高、活性好且形態(tài)佳的心肌細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

不同胎齡及出生后年齡的無(wú)特定病原體級(jí)C57BL/6 小鼠（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）56 只，包括懷孕14.5 d（E14.5）胚胎期小鼠（n=6）、新生1 d 齡（P1）小鼠（n=20）、出生后4 d（P4）小鼠（n=12）、出生后7 d（P7）小鼠（n=12）、成年小鼠（出生后56 d，P56，n=6）。

1.2 心肌細(xì)胞體外分離方法

1.2.1 胰酶消化法

將E14.5 的C57BL/6 雌鼠6 只斷頸處死，剖腹取出胚胎，體式顯微鏡（蔡司Stemi 305，德國(guó)）下取出胚胎小鼠心臟，去除心房組織后放入0.25%含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶（Gibco 公司，美國(guó)）中，37℃消化心臟，每隔3～5 min 輕彈1 次，彈3 次后用含10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco 改良Eagle 培養(yǎng)基（DMEM）（Gibco 公司）終止消化，100 μm 濾網(wǎng)過濾，300×g 離心5 min，去上清，用含10%FBS 的DMEM 重懸細(xì)胞；運(yùn)用差速貼壁法37℃靜置90 min，上清即為心肌細(xì)胞懸液，可用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 新生鼠心臟解離試劑盒法（Gentle MACS 法）

將P1 C57BL/6 小鼠20 只斷頸處死，開胸取出心臟，去除兩個(gè)心房及結(jié)締組織后，利用Neonatal Heart Dissociation Kit（Miltenyi 公 司，德 國(guó)） 及Gentle MACS Octo Dissociator 儀器（Miltenyi 公司，德國(guó)）消化心臟（含酶A：12.5 μl、酶P：62.5 μl、酶D：100 μl、緩沖液Y：25 μl、緩沖液X：23 000 μl）；程序結(jié)束后立即用含10% FBS 的DMEM 終止消化，100 μm 濾網(wǎng)過濾，300×g 離心5 min，去上清；輕彈細(xì)胞后加入紅細(xì)胞裂解液（碧云天公司，上海）裂解紅細(xì)胞，數(shù)分鐘后用磷酸鹽緩沖液（PBS）終止紅細(xì)胞裂解過程，300×g 離心5 min，去上清，用含10% FBS 的DMEM 重懸細(xì)胞；運(yùn)用差速貼壁法37℃靜置90 min，上清即為心肌細(xì)胞懸液，可用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Langendorff 灌流法Langendorff 法分離心肌細(xì)胞步驟簡(jiǎn)述如下：

（1）灌流系統(tǒng)的準(zhǔn)備：提前開啟灌流裝置，開啟加溫器（固定在37℃左右），用去離子超純水或蒸餾水循環(huán)，確保整個(gè)灌流裝置沒有氣泡，以免堵塞血管，造成心肌壞死。同時(shí)，在循環(huán)時(shí)測(cè)灌流滴灌出口的溫度，保持在37℃左右。待心肌灌流前20～30 min，換用新鮮灌注緩沖液進(jìn)行循環(huán)。

（2）取小鼠心臟：6 只P56 C57BL/6 小鼠麻醉前15 min 將0.2 ml 肝素（1 000 U）進(jìn)行腹腔注射作抗凝準(zhǔn)備；按0.18 ml/10 g 的劑量，給小鼠腹腔注射三溴乙醇溶液進(jìn)行麻醉處理；麻醉起效后，將小鼠固定在解剖臺(tái)上。開胸，迅速找到心臟主動(dòng)脈，左手持鑷子將主動(dòng)脈夾住，右手用剪刀靠上部剪下心臟；將剪下的心臟迅速放入預(yù)冷的灌注緩沖液中，立刻將心臟掛在灌流系統(tǒng)上。用灌注緩沖液灌流3～5 min，灌流速度約4～5 ml/min。

（3） 心肌組織的酶解：將膠原酶緩沖液接入灌流裝置，約10 ml 膠原酶緩沖液進(jìn)入灌流裝置時(shí)開始計(jì)時(shí)，同時(shí)觀察心臟心肌的柔軟程度，最初心臟逐漸變硬、膨大、變白，之后慢慢變軟、透明，用手隨時(shí)感覺心臟的變軟程度，大約40 min 時(shí)，剪下，于3 ml 膠原酶緩沖液（循環(huán)灌流時(shí)用過的）中，顯微鑷撕碎心室組織至 1 mm3大小，吸管反復(fù)吹打至無(wú)明顯團(tuán)塊；培養(yǎng)皿中加入5 ml 終止緩沖液終止消化，吹打1 min，過濾至50 ml 離心管；室溫靜置20 min 后去上清，輕彈細(xì)胞，用灌注緩沖液重懸，低速離心或自然沉降后即得心肌細(xì)胞懸液。

1.2.4 非Langendorff 灌流法

取P4、P7 的C57BL/6 小鼠各6 只、P56 的C57BL/6 小鼠3 只，三溴乙醇溶液（0.18 ml/10 g） 麻醉，將小鼠仰臥位固定，開腹后撥開腹腔腸管，剪斷下腔靜脈和腹主動(dòng)脈排空血液；開胸，將1 ml EDTA 緩沖液（含氯化鈉130 mmol、氯化鉀5 mmol、磷酸二氫鈉0.5 mmol、4-羥乙基哌嗪乙磺酸10 mmol、葡萄糖10 mmol、二乙酰一肟10 mmol、牛磺酸10 mmol、EDTA 5 mmol；pH=7.8，試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司）注入右心室；游離升主動(dòng)脈，止血夾夾閉（勿傷及主動(dòng)脈根部）。眼科剪取下心臟后置于含10 ml EDTA 的培養(yǎng)皿中；左心室注射1 ml EDTA 緩沖液后轉(zhuǎn)入含10 ml 灌注緩沖液（含1 mmol 氯化鎂的EDTA 緩沖液，不含EDTA）的培養(yǎng)皿；再次向左心室注射1 ml 灌注緩沖液后轉(zhuǎn)入含 10 ml 膠原酶緩沖液的培養(yǎng)皿；左心室再注射3～5 ml 膠原酶緩沖液（酶成分及終濃度：膠原酶Ⅱ0.5 mg/ml；膠原酶Ⅳ0.5 mg/ml；蛋白酶ⅩⅣ0.05 mg/ml），使心臟呈蒼白色，質(zhì)軟。剪除心房及大血管組織，將心室轉(zhuǎn)入含 1 ml 膠原酶緩沖液的培養(yǎng)皿；顯微鑷撕碎心室組織至1 mm3大小，吸管反復(fù)輕輕吹打至無(wú)明顯團(tuán)塊后加入1.5 ml 終止緩沖液（含5% FBS 的灌注緩沖液）終止消化，輕輕吹打1 min，過濾至50 ml 離心管；20×g 離心5 min，棄上清，輕彈細(xì)胞，用灌注緩沖液重懸，低速離心或自然沉降后即得心肌細(xì)胞懸液。

1.3 心肌細(xì)胞大小及形態(tài)學(xué)檢測(cè)

熒光顯微鏡（蔡司Axio Observer D1，德國(guó)）明場(chǎng)狀態(tài)下成像檢測(cè)心肌細(xì)胞大小，在20 倍放大倍數(shù)下選取3 個(gè)不同的視野測(cè)量心肌細(xì)胞大小，每個(gè)視野測(cè)量10 個(gè)心肌細(xì)胞并取平均值。使用Count Star 儀器（睿鈺生物科技有限公司，上海）檢測(cè)心肌細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞透亮的即為狀態(tài)良好的心肌細(xì)胞。

1.4 心肌細(xì)胞免疫熒光染色

取細(xì)胞懸液涂片，4%多聚甲醛固定20 min，PBS-吐溫20 （PBST） 洗2 遍，PBS 洗3 遍；用含0.3%聚乙二醇辛基苯基醚-X 100（Triton-X 100）的山羊血清封閉1 h；一抗稀釋液稀釋抗α 輔肌動(dòng)蛋白（α-actinin）一抗抗體（Abcam 公司，美國(guó)）后，滴加到細(xì)胞表面，4℃過夜；常溫復(fù)溫1 h；PBST 洗2 遍，PBS 洗3 遍；二抗室溫孵育1 h，PBST 洗2 遍，PBS洗3 遍；用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片劑封片；激光共聚焦顯微鏡（蔡司LSM800，德國(guó)） 成像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 用胰酶消化法分離得到的胚胎期小鼠心肌細(xì)胞存活率及形態(tài)

胚胎期小鼠心肌細(xì)胞存活能力較強(qiáng)，傳統(tǒng)胰酶消化法即可獲得存活率較高的心肌細(xì)胞。我們?nèi)?0 個(gè)E14.5 小鼠心室組織加入400 μl 含EDTA的0.25%胰酶消化液中，15 min 后組織塊基本消化完全。消化結(jié)束后用Count Star 儀器進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞濃度及存活率，同時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胰酶消化法可得到存活率約94%的心肌細(xì)胞，細(xì)胞透亮的即為狀態(tài)良好的心肌細(xì)胞（圖1A）；熒光顯微鏡明場(chǎng)下觀察結(jié)果進(jìn)一步確證細(xì)胞形態(tài)良好（圖1B）。將心肌細(xì)胞懸液利用差速貼壁法進(jìn)行純化，得到較純的心肌細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后用心肌細(xì)胞標(biāo)志物α-actinin 進(jìn)行免疫熒光染色，用DAPI 標(biāo)記細(xì)胞核，利用激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果顯示細(xì)胞具備心肌細(xì)胞典型形態(tài)結(jié)構(gòu)（圖1C）。

2.2 用心臟解離試劑盒法分離得到的新生小鼠心肌細(xì)胞存活率及形態(tài)

將P1 小鼠（n=20）的心肌細(xì)胞用Gentle MACS法按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行分離（此方法適用于P1～P3小鼠心肌細(xì)胞分離）。此方法得到的心肌細(xì)胞存活率可達(dá)97%以上（圖2A），且心肌細(xì)胞形態(tài)良好（圖2B、2C），細(xì)胞長(zhǎng)徑為（40.5 ± 10.2）μm，細(xì)胞短徑為（14.0 ± 0.5） μm。

圖1 用胰酶消化法分離得到的胚胎期小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)

2.3 用心臟解離試劑盒法和非Langendorff 灌流法分離得到的出生后4 d 和7 d 小鼠心肌細(xì)胞存活率和形態(tài)

出生后3 d 以上及成年小鼠心肌細(xì)胞均可用Langendorff 灌流法進(jìn)行分離。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，P4、P7小鼠心臟較小，主動(dòng)脈較細(xì)且極易斷裂，不易將主動(dòng)脈固定在注射器針頭頭部，故不適用Langendorff灌流法分離。因此，本實(shí)施首先運(yùn)用Gentle MACS 法分離了P4、P7 小鼠心肌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞存活率極低，鏡下觀察，幾乎無(wú)桿狀的心肌細(xì)胞（圖3A、4A）。我們隨即進(jìn)一步用2016年文獻(xiàn)報(bào)道的一種心肌細(xì)胞新分離方法——非Langendorff 灌流法對(duì)P4、P7 小鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)得到的心肌細(xì)胞存活率可達(dá)70%～80%，細(xì)胞涂片后在熒光顯微鏡明場(chǎng)下觀察及免疫熒光染色后鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞形態(tài)良好，桿狀細(xì)胞較多（圖3B～3D、圖4B～4D）；P4小鼠心肌細(xì)胞長(zhǎng)徑為（56.9 ± 4.3）μm，細(xì)胞短徑為（12.3 ± 5.6） μm；P7小鼠心肌細(xì)胞長(zhǎng)徑為（60.0 ± 4.0）μm，細(xì)胞短徑為（15.8 ± 3.2）μm。

2.4 用Langendorff 灌流法和非Langendorff 灌流法分離得到的成年小鼠心肌細(xì)胞存活率和形態(tài)

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)用傳統(tǒng)Langendorff 灌流法和非Langendorff 灌流法分離P56 小鼠的心肌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種分離方法均可得到存活率較高的桿狀心肌細(xì)胞，且桿狀率均在70%～80%之間，細(xì)胞存活率維持在70%左右（圖5）。P56 小鼠心肌細(xì)胞長(zhǎng)徑為（70.2± 10.9）μm，細(xì)胞短徑為（23.7 ± 6.4）μm。

圖3 用心臟解離試劑盒法和非Langendorff 灌流法分離得到的出生后4 d 小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)

圖4 用心臟解離試劑盒法和非Langendorff 灌流法分離得到的出生后7 d 小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)

圖5 用Langendorff 灌流法和非Langendorff 灌流法分離得到的成年小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)

3 討論

胎期期及出生后不同年齡段小鼠原代心肌細(xì)胞的體外分離已成為心血管研究的基本方法和手段之一，對(duì)于研究心肌細(xì)胞的電生理學(xué)、信號(hào)傳導(dǎo)、藥物測(cè)試以及單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)有著重要意義[7-15]。目前已有較為成熟的心肌細(xì)胞體外分離方法，但對(duì)于胚胎期及出生后不同年齡段小鼠尚少有系統(tǒng)性的研究。因此，研究者需查閱大量文獻(xiàn)，即便按照文獻(xiàn)步驟進(jìn)行分離也易出現(xiàn)大量未知錯(cuò)誤，重復(fù)性較差，并且需深入探討諸多影響因素。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同年齡段小鼠心肌細(xì)胞體外分離的方法進(jìn)行了系統(tǒng)性探索及優(yōu)化，得到了不同時(shí)期小鼠心肌細(xì)胞分離的最優(yōu)方法，獲得了活性高且狀態(tài)好的心肌細(xì)胞，且心肌細(xì)胞大小與文獻(xiàn)報(bào)道相符[16]，能夠滿足心血管病發(fā)生、發(fā)展的多種生理生化實(shí)驗(yàn)及心臟組織工程學(xué)研究的要求。

根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道以及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，胚胎期小鼠心肌細(xì)胞的體外分離方法為胰酶消化法，可得到存活率為85%以上的心肌細(xì)胞。該法所需胰酶體積及消化時(shí)間需根據(jù)心臟大小及心臟個(gè)數(shù)而定。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于E14.5 小鼠來(lái)說(shuō)，消化10 個(gè)心臟大約需400 μl 胰酶，37℃消化兩次，每隔5 min 輕彈一次，即可獲得存活率高的心肌細(xì)胞。對(duì)于新生小鼠（出生后1～3 d），心肌細(xì)胞的體外分離方法優(yōu)先選擇Gentle MACS 法，可獲得活性約97%的心肌細(xì)胞。Gentle MACS 法中約20 個(gè)心臟用一個(gè)體系的酶量（2.5 ml），心臟較多時(shí)只需相應(yīng)增加酶量即可。此外，在分離程序結(jié)束后應(yīng)立即用預(yù)熱的含10%FBS 的DMEM 終止消化，否則會(huì)因消化過度而影響心肌細(xì)胞存活。在每次離心結(jié)束后，應(yīng)輕彈細(xì)胞，力度不宜過大，以免細(xì)胞破碎。

與Gentle MACS 法相比，出生后4 d 和7 d 的小鼠心肌細(xì)胞體外分離可優(yōu)先選擇非Langendorff 灌流法，分得的心肌細(xì)胞存活率在70%～80%之間。用非Langendorff 灌流法分離心肌細(xì)胞時(shí)，應(yīng)嚴(yán)加把控注射酶的速度，速度過快會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞斷裂，桿狀細(xì)胞率降低。此外，應(yīng)用37℃預(yù)熱好的酶液進(jìn)行注射，以更好的模擬體內(nèi)環(huán)境。P4、P7 小鼠可用低速離心的方法將心肌細(xì)胞沉淀，而P56 小鼠因心肌細(xì)胞體積較大且易斷裂，應(yīng)用自然沉降的方法進(jìn)行細(xì)胞沉降，以去除非心肌細(xì)胞。

目前，Langendorff 灌流法分離成年心肌細(xì)胞方法已較為成熟，但是其影響因素較多，包括灌流系統(tǒng)的穩(wěn)定性、灌流液的溫度、酶的選擇、濃度及消化時(shí)間及操作者的熟練程度等諸多細(xì)節(jié)均可能影響心肌細(xì)胞的狀態(tài)[17-18]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)緩沖液的各種成分間的配比進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)如果在消化液中加入蛋白酶會(huì)在灌流過程中產(chǎn)生大量氣泡，故最好不加蛋白酶。此外，應(yīng)嚴(yán)格把控灌注緩沖液及膠原酶緩沖液pH值的穩(wěn)定性，pH值發(fā)生改變會(huì)在很大程度上影響心肌細(xì)胞的活性。尤為重要的是，在整個(gè)灌流過程中應(yīng)嚴(yán)格避免氣泡進(jìn)入心臟組織中。相反，非Langendorff 灌流法較為簡(jiǎn)便，易于操作，無(wú)需特定實(shí)驗(yàn)器材，只需注意注射酶液的速度，即可得到存活率較高的桿狀心肌細(xì)胞。

總之，本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)研究了胚胎期及出生后不同年齡段小鼠心肌細(xì)胞的體外分離方法并進(jìn)行了優(yōu)化，得到的最優(yōu)分離方法獲得的心肌細(xì)胞純度高、活性好、形態(tài)佳，且這些方法操作簡(jiǎn)便有效、重復(fù)性強(qiáng)，為心肌細(xì)胞的電生理學(xué)、信號(hào)傳導(dǎo)、藥物測(cè)試以及單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)等諸多研究的開展提供了重要的基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突