許嘉宇,李 忍,田志軍,陳洪巖,王玉娥

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱150069)

細(xì)胞凋亡包括內(nèi)源性凋亡和外源性凋亡2種方式，內(nèi)源性凋亡是細(xì)胞器釋放的凋亡蛋白促發(fā)的，外源性凋亡主要由腫瘤壞死因子(Tumor necrosis facter,TNF)超家族相關(guān)分子與腫瘤壞死因子受體(Tumer necrosis factor receptor,TNFR)相結(jié)合誘導(dǎo)產(chǎn)生的[1]。凋亡在許多病毒感染過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，病毒感染的細(xì)胞可通過(guò)啟動(dòng)凋亡而抑制病毒的感染。有研究表明，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)在感染的早期可通過(guò)下調(diào)p53的表達(dá)發(fā)揮抗凋亡的作用，進(jìn)而有助于病毒的感染[2]。而在感染的晚期，PRRSV可通過(guò)抑制PI3K依賴的AKT通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡[3]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV感染可刺激豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)分泌TNF-α，分泌型的TNF-α可抑制PRRSV的感染[4]。TNF-α是通過(guò)與TNFR結(jié)合后募集細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白，激活凋亡信號(hào)通路發(fā)揮功能[5]。因此TNFR1可能參與PRRSV引起的凋亡，但目前尚無(wú)TNFR1在PRRSV感染過(guò)程中的功能的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，在PRRSV感染的PAM細(xì)胞中TNFR1以2種分子量不同的形式TNFR1和TNFR1-d3存在，其中，TNFR1-d3有129 bp堿基的缺失突變。與野生型TNFR1相比，突變型TNFR1-d3不具有促進(jìn)TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡功能，說(shuō)明該129 bp堿基參與調(diào)控細(xì)胞凋亡。本研究揭示了PRRSV感染和細(xì)胞凋亡的新機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)、人胚腎細(xì)胞(HEK293)、PRRSV HuN4株，均由本實(shí)驗(yàn)室保存； 大腸桿菌DH5α感受態(tài)由本實(shí)驗(yàn)室制備；pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體，購(gòu)自Invitrogen公司；RIPA裂解液、MLV反轉(zhuǎn)錄酶，均購(gòu)自海基生物科技有限公司；DEPC水，購(gòu)自BIOSHARP公司；RNA提取試劑盒RNeasy Plus Mini Kit，購(gòu)自QIAGEN公司；放線菌酮、Flag單克隆抗體和β-actin單克隆抗體，均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司；豬源重組蛋白TNF-α，購(gòu)自R&D公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中已登錄的豬源TNFR1的基因序列(NM.213969.1)，用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，見表1，由吉林庫(kù)美生物科技有限公司合成。

表1 PCR擴(kuò)增引物Table 1 Primers used in amplification

1.3TNFR1和TNFR1-d3真核載體的構(gòu)建及鑒定 PRRSV HuN4株感染PAM細(xì)胞24 h后， 提取RNA，將其反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用表1的上下游引物(退火溫度：60 ℃)，按傳統(tǒng)方法進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的片段。將擴(kuò)增的目的基因(TNFR1和TNFR1-d3)片段純化后經(jīng)KpnI /EcoR I雙酶切，并分別克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1 (+)中獲得重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TNFR1 和pcDNA3.1-TNFR1-d3，送至吉林庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序鑒定。

1.4TNFR1和TNFR1-d3真核載體表達(dá)及鑒定 將構(gòu)建好的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-TNFR1 和pcDNA3.1-TNFR1-d3分別轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h后，裂解細(xì)胞收集蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳；將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上， 于5%脫脂乳中室溫封閉2 h；然后用 PBST 漂洗 3 次，每次 10 min； 4 ℃條件下，與相應(yīng)一抗(anti-Flag: 1∶1 000，anti-β-actin: 1∶10 000)于水平搖床孵育過(guò)夜；PBST漂洗3次，每次漂洗10 min； 然后用相應(yīng)標(biāo)記的二抗室溫條件下避光反應(yīng)45 min，PBST洗滌3次，每次洗滌10 min；用近紅外熒光掃描儀掃描PVDF膜保存并分析試驗(yàn)結(jié)果。

1.5 TNFR1和TNFR1-d3對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 將構(gòu)建好的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-TNFR1 和pcDNA3.1-TNFR1-d3分別轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染24 h后，加入TNF-α(10ng/mL)+放線菌酮(2 μg/mL) 處理細(xì)胞4 h誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TNFR1和TNFR1-d3對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。棄掉處理細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌貼壁細(xì)胞1次，加入適量胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來(lái)，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1 000 g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，PBS洗細(xì)胞1次。取約100萬(wàn)個(gè)重懸的細(xì)胞，1 000 g離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。室溫避光孵育20 min，使用貝克曼CytomicsTMFC 500流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PRRSV感染PAM細(xì)胞產(chǎn)生2種分子大小不同的TNFR1 分別以接種PRRSV HuN4株24 h和沒有任何做處理的PAM細(xì)胞提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，利用表1中的上下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的片段，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳結(jié)果如圖1所示， 從PRRSV HuN4株感染的PAM細(xì)胞中擴(kuò)增產(chǎn)生2條大小不同的DNA條帶，而從陰性對(duì)照PAM細(xì)胞中擴(kuò)增只產(chǎn)生1條帶。

2.2TNFR1和TNFR1-d3測(cè)序結(jié)果及分析 從PRRSV HuN4株感染的PAM細(xì)胞中擴(kuò)增產(chǎn)生2條大小不同的DNA條帶 (TNFR1和TNFR1-d3),膠回收后，用KpnI和EcoR I雙酶切連接到pcDNA3.1(+)中，重組質(zhì)粒測(cè)序比對(duì)后得到圖2結(jié)果，發(fā)現(xiàn)較小的目的條帶TNFR1-d3和較大的目的條帶TNFR1相比，缺失129 bp堿基。進(jìn)一步分析測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺失的129 bp是TNFR1的第3外顯子上，如圖3。

圖1 PRRSV感染PAM細(xì)胞產(chǎn)生2種分子 大小不同的TNFR1Fig.1 Two different sizes of TNFR1 in PAMs infected with PRRSV

圖2TNFR1和TNFR1-d3測(cè)序結(jié)果比對(duì)
Fig.2 Sequence alignment of theTNFR1 andTNFR1-d3

圖3TNFR1-d3缺失位置
Fig.3 Deletion of theTNFR1-d3

2.3 pcDNA3.1-TNFR1 和pcDNA3.1-TNFR1-d3轉(zhuǎn)染細(xì)胞后表達(dá)情況 將構(gòu)建好的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-TNFR1 和pcDNA3.1-TNFR1-d3分別轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，于轉(zhuǎn)染后24 h，裂解細(xì)胞收集蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上， Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,pcDNA3.1-TNFR1 和pcDNA3.1-TNFR1-d3都能正常表達(dá)(圖4)。

圖4 pcDNA3.1-TNFR1 和pcDNA3.1-TNFR1-d3重組質(zhì)粒的表達(dá)
Fig.4 Expression of recombinant plasmidspcDNA3.1-TNFR1 and pcDNA3.1-TNFR1-d3

2.4 TNFR1和TNFR1-d3在TNFα誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用 將構(gòu)建好的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-TNFR1 和pcDNA3.1-TNFR1-d3分別轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞中，于轉(zhuǎn)染后24 h用TNF-α結(jié)合放線菌酮處理細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。用FITC標(biāo)記的Annexin V作為探針，標(biāo)記磷脂酰絲氨酸(Phosphotidylserine，PS)來(lái)檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的發(fā)生。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(Untreat)相比，過(guò)表達(dá)TNFR1細(xì)胞的凋亡比例明顯升高，而過(guò)表達(dá)TNFR1-d3細(xì)胞的凋亡比例與對(duì)照組(Untreat)相比幾乎沒有變化(圖5)。結(jié)果表明，TNFR1具有明顯的促凋亡功能，而當(dāng)TNFR1缺失第3外顯子后其促凋亡能力消失。

圖5 流式細(xì)胞檢測(cè)TNFR1和TNFR1-d3 在細(xì)胞凋亡中的作用Fig.5 Flow cytometry detects the function of TNFR1 and TNFR1-d3 in apoptosis

3 討論

病毒會(huì)在感染的早期通過(guò)不同的機(jī)制抑制宿主細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)自身的復(fù)制；在感染的晚期促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，有助于病毒粒子的釋放。已報(bào)道的研究指出，PRRSV在感染的過(guò)程中也有類似的現(xiàn)象存在[6-7]。TNFR1是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要受體分子之一。本研究發(fā)現(xiàn)在PRRSV感染后，可以引起PAM細(xì)胞TNFR1出現(xiàn)2種不同剪接體：野生型TNRF1和缺失型TNFR1-d3。這2種剪接體的差異在于TNFR1-d3較野生型TNRF1在第3外顯子(129 bp)處缺失，這種缺乏第3外顯子的剪切體TNFR1-d3是第一次被發(fā)現(xiàn)。已有文獻(xiàn)報(bào)道TNFR1存在缺乏第2外顯子的剪切突變體TNFR1-d2，其存在具有組織特異性[8]。另有研究指出，TNFR1存在缺失第6外顯子的替代轉(zhuǎn)錄本TNFR1-d6，該種轉(zhuǎn)錄本不能引起NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[9]。TNFR1是I型跨膜蛋白，由N端胞外結(jié)構(gòu)域(與TNF結(jié)合的部位)，α螺旋跨膜結(jié)構(gòu)域、近膜區(qū)和C端胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域組成。C端胞內(nèi)區(qū)可以與細(xì)胞內(nèi)的接頭蛋白TRADD或FADD/MORT1結(jié)合形成凋亡復(fù)合物引發(fā)細(xì)胞凋亡[10]。由于TNFR1的第3外顯子位于N端胞外區(qū)，是與TNF結(jié)合的部位，因此我們推測(cè)缺失129 bp 的TNFR1-d3可能會(huì)影響由TNFR1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的功能。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)TNFR1會(huì)引起TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而過(guò)表達(dá)TNFR1-d3幾乎失去了由TNF-α處理誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。這就說(shuō)明PRRSV感染可能啟動(dòng)某種機(jī)制，使得TNFR1缺失第3外顯子轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生，降低細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)病毒的感染復(fù)制。本研究闡明了PRRSV在早期抑制細(xì)胞凋亡的一種機(jī)制。