張桂枝,龍瑞艷,徐明國,靳雙星

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院動物科技學(xué)院,河南鄭州450046 ； 2.河南省家禽疾病防控工程技術(shù)研究中心,河南鄭州450046 ； 3.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院,新疆石河子832003)

禽白血病(Avian leukosis,AL)是重要的種源性疾病和免疫抑制性疾病，全國獸醫(yī)衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展規(guī)劃(2016-2020年)將AL列為重點凈化的家禽疫病。按照國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012-2020年)要求，到2020年國內(nèi)全部種雞場AL達到凈化標準。盡管國內(nèi)許多種雞場開展了AL的凈化工作，但目前該病在我國雞群中感染仍比較復(fù)雜，特別是地方品種雞經(jīng)常出現(xiàn)2種或2種以上亞型混合感染[1-9]，以及禽白血病病毒(ALV)和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)混合感染[10-14]。張倩在2011-2016年間對我國19個省60個祖代場ALV的感染情況進行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALV- p27抗原場陽性率為18.75%～66.67%，ALV-J抗體場陽性率為26.3%～64.71%，ALV-AB抗體場陽性率為36.84%～88.24%[14]。馬美哥等從2018年以來進口的某品種肉種雞體內(nèi)分離出了J亞群禽白血病病毒[15]。垂直傳播為ALV的主要傳播方式，其決定了感染的延續(xù)性和持續(xù)性；水平傳播保證了ALV得以維持。為了探討陰性雞與先天感染ALV-J的陽性雞接觸一定時間后，ALV-J的水平傳播情況，特開展本試驗，旨在為種雞場制定禽白血病凈化方案和更好地開展本病凈化提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 陽性雞來源于河南省某地方品種雞場；陰性雞由SPF種蛋(購自北京勃林格殷格翰維通生物科技有限公司)在河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院家禽生產(chǎn)實驗室孵化機內(nèi)孵化而成。

1.1.2 主要試劑 超純RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA Synthesis Kit試劑盒、2×EsTaqMaster Mix，均購自康為世紀生物科技有限公司； ALV-J 抗體檢測試劑盒、ALV- p27抗原檢測試劑盒，均購自美國IDEXX公司； 抗ALV- J單克隆抗體JE9由揚州大學(xué)秦愛建教授惠贈；FITC標記羊抗鼠IgG熒光抗體(bs-0310G-FITC)，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)液、新生牛血清，均購自GIBCO公司。

1.1.3 細胞 DF-1細胞由河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院中心實驗室保存。

1.1.4 主要儀器 ELISA酶標儀、二氧化碳培養(yǎng)箱，均購自Thermo公司；PCR儀，購自美國ABI公司；凝膠成像系統(tǒng)，購自DNR公司；核酸凝膠電泳儀，購自Bio-RAD公司；倒置熒光顯微鏡，購自日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物的選擇 陽性雞的選擇：0日齡采集胎糞，利用ELISA方法檢測其ALV-p27，并于7日齡采集血漿接種DF-1細胞，取細胞培養(yǎng)液利用RT-PCR檢測ALV-J抗原，二者均為陽性的20只雞作為陽性雞。陽性雞和60只陰性雞在同一籠內(nèi)飼養(yǎng)，按照種雞的飼養(yǎng)管理標準正常飼養(yǎng)和接種免疫。

1.2.2 胎糞和泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原檢測 按照IDEXX ALV- p27抗原檢測試劑盒說明書進行檢測。

1.2.3 血清ALV-J抗體檢測 采集試驗雞促凝血，離心分離血清，然后按照IDEXX ALV-J抗體檢測試劑盒說明書檢測相應(yīng)抗體。

1.2.4 外源性ALV的分離 將DF-1細胞傳至6孔細胞培養(yǎng)板，細胞長成 60%～70%單層時，取200 μL試驗雞血漿接種于DF-1細胞，37 ℃ 繼續(xù)孵育2 h，棄上清液，更換為含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃ 5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)9 d后，用ALV-p27抗原ELISA檢測試劑盒逐孔檢測p27抗原，并通過RT-PCR檢測ALV-p27。

1.2.5 引物設(shè)計與合成 針對ALV相對保守的p27基因序列和ALV-J的特異性gp85基因序列設(shè)計合成鑒定引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物名稱、序列以及目的片段大小見表1。

表1 ALV-p27、ALV-J 鑒定引物Table 1 The identification primer of ALV-p27、ALV-J

1.2.6 RT-PCR檢測ALV-p27及ALV-J亞群鑒定 收集接種試驗雞血漿培養(yǎng)9 d后的細胞培養(yǎng)上清液，高速離心除去細胞碎片后，使用超純RNA提取試劑盒提取總RNA，以此為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得病毒基因組cDNA。并以此cDNA為模板，分別用 ALV- p27的鑒定引物和ALV-J 特異性引物進行PCR 擴增。ALV- p27 的反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。ALV-J反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 40 s，64 ℃ 30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。用 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.2.7 ALV-J的間接免疫熒光鑒定(IFA) 接種試驗雞血漿的DF-1細胞培養(yǎng)9 d后用PBS 洗細胞3 次，每次5 min；然后用4%多聚甲醛常溫固定20 min； 棄去固定液，自然干燥，再用PBS 漂洗3 次，每次5 min；加入抗ALV- J單克隆抗體JE9，37 ℃孵育1 h后用PBS漂洗3次，每次5 min；再加入FITC標記羊抗鼠IgG熒光抗體，37 ℃ 孵育1 h，用PBS漂洗3次，使用倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 泄殖腔ALV-p27檢測結(jié)果 陰性雞與陽性雞直接接觸7、15、25、35、45、55、65、75 d和90 d后，泄殖腔ALV-p27陽性率變化動態(tài)曲線見圖1。由圖1可知，陰性雞與陽性雞接觸15 d，有3.33%雞只泄殖腔中可檢測到ALV-p27抗原。從15～45 d泄殖腔ALV-p27陽性率逐漸增高，55 d略有降低，65 d陽性率達高峰為50.00%，65～90 d泄殖腔ALV-p27抗原陽性率逐漸降低。

圖1 陰性雞與陽性雞接觸一定時間后泄殖腔帶毒排毒動態(tài)
Fig.1 After mixing antigen-negative and antigen-positivechickens for a period of time,the intoxication anddetoxification in cloaca of antigen-negative

2.2 血漿病毒分離結(jié)果 陰性雞與陽性雞直接接觸65 d，血漿中外源性ALV分離陽性率見表2。由表2可知，采用ELISA、RT-PCR兩種方法檢測DF-1細胞培養(yǎng)液中外源性ALV，陽性率分別為60.00%、56.67%。其中RT-PCR檢測為陰性的1個樣品，ELISA檢測為陽性；其他樣品2種檢測方法結(jié)果完全吻合。說明ELISA和RT-PCR檢測的匹配度很高；陰性雞與陽性雞早期密切接觸，外源性ALV的感染幾率相當高。圖2為RT-PCR檢測ALV-p27在720 bp處擴增到的特異性條帶。

表2 外源性ALV分離陽性率Table 2 The positive rates of exogenous ALV

圖2 ALV-p27 RT-RCR檢測電泳圖
Fig.2 ALV-p27 results by RT-RCRM:Marker;1～7:部分樣品 M:Marker; 1～7:Some samples

2.3 ALV-J亞型鑒定結(jié)果 陰性雞與陽性雞直接接觸65 d，采用RT-PCR和IFA檢測到ALV-J抗原陽性率分別為56.67%和63.33%，結(jié)果見表3。圖3為RT-PCR檢測ALV-J在924 bp處擴增到的特異性條帶；圖4和圖5分別為采用IFA檢測ALV- J陰性樣品和陽性樣品結(jié)果。

表3 ALV-J亞型鑒定結(jié)果Table 3 The results of ALV-J Subtype identification

圖3 ALV-J RT-RCR檢測電泳圖
Fig.3 Detection electrophoretic diagram ofALV-J by RT-RCRM:Marker; 1～7: 部分樣品 M:Marker; 1～7: Some samples

圖4 ALV-J IFA檢測陰性樣品熒光顯微鏡(10×10)觀察結(jié)果
Fig.4 ALV-J results of negative samples by IFAfluorescence microscopy(10×10)

圖5 ALV-J IFA檢測陽性樣品熒光顯微鏡觀察結(jié)果(10×10)
Fig.5 ALV-J results of negative samples by IFAfluorescence microscopy(10×10)

2.4 血清中ALV-J抗體檢測結(jié)果 陰性雞與陽性雞直接接觸7、15、25、35、45、55、65、75 d和90 d，血清抗體陽性率變化動態(tài)見圖6。由圖6可知，陰性雞與陽性雞直接接觸7～35 d，陰性雞血清中一直未檢測到ALV-J抗體；45 d ALV-J抗體陽性率為20%，隨后ALV-J抗體陽性率逐漸上升，65 d達最高峰為63.33%，65～90 d逐漸降低。

圖6 陰性雞與陽性雞接觸一定時間后抗體產(chǎn)生動態(tài)
Fig.6 The serum antibodies of antigen-negativehicken after mixing antigen-negative andantigen-positive chickens for a period of time

3 討論

本試驗結(jié)果表明，陰性雞與感染ALV-J陽性雞接觸15 d，泄殖腔中可檢測到ALV-p27抗原，從15～45 d泄殖腔ALV-p27陽性率逐漸增多，65 d陽性率達高峰為50.00%，45～90 d泄殖腔均維持較高的抗原陽性率；65日齡采集陰性雞血液接種DF-1細胞，利用ELISA、RT-PCR檢測到細胞培養(yǎng)液中外源性ALV陽性率分別為60.00%和56.67%；利用RT-PCR和IFA方法檢測到細胞培養(yǎng)液中ALV-J抗原陽性率分別為56.67%和63.33%。陰性雞與感染ALV-J陽性雞直接接觸45 d ALV-J抗體陽性率為20%；隨后ALV-J抗體陽性率逐漸上升，65 d達高峰為63.33%。說明陰性雞與先天感染ALV-J的陽性雞直接接觸混合飼養(yǎng)，通過水平傳播被感染外源性ALV的幾率相當高，這與許多資料報道的外源性ALV可以通過直接或間接接觸從一只雞傳染給其他雞[16-17]相一致。本試驗表明，陰性雞與陽性雞直接接觸水平傳播被感染ALV-J雞只泄殖腔排毒、血液帶毒和抗體產(chǎn)生，65日齡均處于高峰。因此，在開展禽白血病凈化時，65日齡左右是檢測的一個關(guān)鍵時期。

出雛時，雛雞之間的緊密接觸是ALV橫向傳播的一種有效傳播途徑，經(jīng)垂直傳染帶有ALV的雛雞體內(nèi)病毒粒子具有很高的感染性，可通過胎糞向外排毒，同時雛雞又有相互啄肛的習(xí)慣，導(dǎo)致很高比例的出殼雛雞被橫向傳播。老齡雞的唾液和糞便中也存在感染性病毒粒子，都是ALV水平傳播的傳染源。

本試驗采用ELISA、RT-PCR兩種方法檢測細胞培養(yǎng)液中的ALV-p27，采用RT-PCR和IFA兩種方法檢測ALV-J抗原，檢測結(jié)果符合率相當高。但RT-PCR方法檢測到的2個陰性樣本IFA方法檢測為陽性，這與陳俊霞研究報道IFA檢測的靈敏度更高，可檢測出一些低滴度的樣品，尤其當病毒含量較低時該方法優(yōu)勢更明顯相符合[16]。