劉 瑩,賈敬亮,劉 濤,袁廣富,陳少杰,王 晶,范京惠,左玉柱

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河北保定071001 ； 2.衡水市畜牧技術(shù)推廣站,河北衡水053000 ； 3.石家莊市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,河北石家莊050000)

豬Delta冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)和豬流行性腹瀉病毒(Porcire epidemic diarrhea virus, PEDV)均是引起仔豬腹瀉病的重要病原，二者臨床癥狀極為相似，且常常混合感染，僅根據(jù)臨床上的方法較難進(jìn)行鑒別與診斷，傳統(tǒng)檢測(cè)方法最大的缺點(diǎn)就是檢測(cè)周期長(zhǎng)，工作繁瑣并配備專業(yè)人員進(jìn)行檢測(cè)，特異性與靈敏度也較差，因此，建立一種同時(shí)檢測(cè)PDCoV和PEDV的快速檢測(cè)方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病毒來(lái)源 豬流行性腹瀉病毒、豬Delta冠狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬博卡病毒(PBoV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)陽(yáng)性病料，均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室鑒定、保存。

1.2 儀器與試劑 DL-2 000 DNA Marker(MD114)、RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒，均為寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；2×TaqPCR Mix為中科瑞泰生物科技有限公司產(chǎn)品；Protein simple凝膠成像系統(tǒng)為普諾森生物科技(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 利用 Primer 5.0 引物設(shè)計(jì)的軟件，根據(jù)GenBank中收錄的PEDVM基因和PDCoVM基因中獲得的保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)2對(duì)引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增PEDV的M基因部分片段520 bp，擴(kuò)增PDCoV的M基因部分片段340 bp，引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成(見表1)。

表1 PEDV與PDCoV引物信息Table 1 Primer used for amplification and sequencing of PEDV and PDCoV

1.4 病毒核酸的提取及cDNA的獲取 由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室鑒定保存的病毒陽(yáng)性病料，參照RNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行病毒核酸的提取，并使用RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。

1.5 PDCoV和PEDV單一PCR擴(kuò)增 用1.4中所得到的PEDV和PDCoV的cDNA作為模板進(jìn)行單一RT-PCR擴(kuò)增的體系為：2×TaqPCR Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL。PCR反應(yīng)擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得到目的條帶并進(jìn)行回收，將回收的目的片段連接至pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行提取后，放于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 PDCoV與PEDV的雙重RT-PCR擴(kuò)增 根據(jù)1.5中單一RT-PCR的擴(kuò)增反應(yīng)條件，以PDCoV和PEDV的重組質(zhì)粒為模板，通過對(duì)退火溫度、引物終濃度、反應(yīng)體積進(jìn)行優(yōu)化，并按上述方法進(jìn)行凝膠電泳鑒定。

1.7 雙重RT-PCR特異性試驗(yàn) 分別對(duì)PRV、PBoV、TGEV和PRRSV的核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用本試驗(yàn)PDCoV和PEDV的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并在凝膠電泳中進(jìn)行擴(kuò)增特異性的驗(yàn)證。

1.8 PDCoV和PEDV單一和雙重RT-PCR敏感性試驗(yàn) 將PDCoV和PEDV的單一質(zhì)粒，測(cè)定濃度后，進(jìn)行10倍倍比稀釋，分別作為模板，驗(yàn)證單一及雙重RT-PCR檢測(cè)方法的敏感性。

1.9 臨床樣品檢測(cè) 2018年以來(lái),本實(shí)驗(yàn)室收集到的232份河北各地市養(yǎng)豬場(chǎng)仔豬腹瀉部分樣品進(jìn)行檢測(cè)，用此雙重RT-PCR的檢測(cè)方法從仔豬腹瀉病料中進(jìn)行特異性的檢測(cè)，并將雙重RT-PCR和單一RT-PCR進(jìn)行結(jié)果對(duì)比。

2 結(jié)果

2.1 PDCoV和PEDV的RT-PCR特異性擴(kuò)增 以PDCoV和PEDV的重組質(zhì)粒和單一質(zhì)粒分別作為模板，再分別以TGEV、PRRSV、PBoV和PRV為模板，利用本試驗(yàn)PDCoV和PEDV的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果僅PDCoV和PEDV能擴(kuò)增出特異性條帶，而其他病毒均無(wú)特異性條帶(見圖1)。

2.2 單一和雙重 RT-PCR 敏感性試驗(yàn) 以PDCoV和PEDV的重組質(zhì)粒進(jìn)行倍比稀釋后作為模板，用此雙重RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，單一PCR對(duì)PDCoV和PEDV最低檢測(cè)量分別為3.27×103拷貝/μL，3.63×104拷貝/μL(見圖2)。

2.3 多重PCR的臨床檢測(cè) 2018年以來(lái)，本實(shí)驗(yàn)室收集到的232份河北各地市養(yǎng)豬場(chǎng)仔豬腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)，臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示(見表2)，在232份未知樣品中，PDCoV的陽(yáng)性樣品41份，陽(yáng)性率為17.67%；PEDV的陽(yáng)性樣品62份，陽(yáng)性率為26.72%；PDCoV和PEDV的陽(yáng)性樣品28份，陽(yáng)性率為12.07%，所建立雙重RT-PCR的檢測(cè)方法可以從仔豬腹瀉病料中特異性的檢測(cè)出PDCoV和PEDV，并將雙重RT-PCR和單一RT-PCR進(jìn)行結(jié)果對(duì)比，檢測(cè)結(jié)果相一致，符合率100%。

圖1 雙重RT-PCR的特異性試驗(yàn)
Fig.1 Specificity of the duplex RT-PCR products ofPDCoV and PEDV detectionM：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1: PEDV和PDCoV的雙重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 2:PDCoV的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 3: PEDV的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 4～7:分別為TGEV、PRRSV、PBOV、PRV的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
M: DL-2 000 DNA Marker; 1: The duplex PCR products of PDCoV and PEDV; 2: The PCR products of PDCoV; 3: The PCR products of PEDV; 4～7: The PCR products of TGEV, PRRSV, PBoV, PRV

圖2 雙重RT-PCR的敏感性試驗(yàn)
Fig.2 Sensitivity test of duplex RT-PCR
M: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～7:1×10-1～1×10-7拷貝/μL
M: DL-2000 DNA Marker; 1～7: 1×10-1～1×10-7copies/μL

3 討論

豬Delta冠狀病毒是一種新發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒, 在臨床上主要影響仔豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉和脫水等癥狀，與PEDV癥狀極為相似。2012年Woo等[1]在香港首次檢測(cè)出了PDCoV，美國(guó)于2014年在腹瀉的仔豬和母豬中首次發(fā)現(xiàn)了PDCoV[2]，此后PDCoV在韓國(guó)和加拿大也相繼發(fā)現(xiàn)和報(bào)道了PDCoV[3]。隨后Dong等[4]對(duì)2004-2014年安微、廣西、湖北、江蘇4個(gè)地區(qū)病料的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，2004年的病料中就存在PDCoV，并且在國(guó)內(nèi)外均有比較高的檢出率，給散養(yǎng)戶或規(guī)模性養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大危害。豬流行性腹瀉病毒在歐洲和亞洲等規(guī)?；B(yǎng)豬行業(yè)較發(fā)達(dá)的地區(qū)都有過相關(guān)報(bào)道[5-9]。1971年在英國(guó)首次報(bào)道了PEDV，我國(guó)從20世紀(jì)80年代初開始陸續(xù)有 PEDV 的發(fā)生。1991年國(guó)際病毒分類委員會(huì)(ICTV)第5次報(bào)告將PEDV列為冠狀病毒屬的可能成員,1991年第6次報(bào)告將其列為冠狀病毒屬的正式成員[10]。

表2 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果Table 2 Clinical sample test results

豬Delta冠狀病毒與豬流行性腹瀉病毒感染極為類似,且混合感染時(shí)有發(fā)生,單靠臨床診斷很難區(qū)分2種疾病, 給散養(yǎng)戶或規(guī)模性養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大危害。因此，建立同時(shí)檢測(cè)且區(qū)分PDCoV和PEDV的檢測(cè)方法具有重要的臨床意義。根據(jù)GenBank 中 PDCoV和PEDV的基因序列保守區(qū)，分別對(duì)于PDCoVM基因和PEDVM基因設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，并對(duì)PDCoV和PEDV保守性極高的M基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，并通過對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了同時(shí)檢測(cè)PDCoV和PEDV的雙重PCR檢測(cè)方法，該方法對(duì)于PDCoV和PEDV的最低檢測(cè)量分別是3.27×103拷貝/μL和3.63×104拷貝/μL，并且具有良好的特異性和敏感性，進(jìn)一步在實(shí)踐中驗(yàn)證此方法的可靠性，為獸醫(yī)臨床診斷及監(jiān)測(cè)、流行病學(xué)的調(diào)查提供了理論基礎(chǔ)。很多專家學(xué)者對(duì)各種腹瀉病已經(jīng)有了相關(guān)研究，任玉鵬等[11]建立了PDCoV、TGEV和PEDV多重RT-PCR方法。劉玲玲等[12]也建立了PDCoV和TGEV的雙重RT-PCR檢測(cè)方法。

本試驗(yàn)是根據(jù)近年來(lái)河北各地市及其周邊地市養(yǎng)豬場(chǎng)仔豬腹瀉病毒病的流行病學(xué)的調(diào)查，選取了在目前仔豬腹瀉病中感染率比較高的2種腹瀉病毒病-

豬Delta冠狀病毒(PDCoV)和豬流行性腹瀉(PEDV)進(jìn)行研究，從而建立2種病毒的雙重RT-PCR檢測(cè)方法。