孟志敏,黃占欣,趙 達(dá),魏淑玲

(1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,河北邯鄲056000 ； 2.河北省石家莊市藁城區(qū)畜牧工作總站 ，河北石家莊052160； 3.河北省農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校石家莊市鹿泉區(qū)分校,河北石家莊050200)

傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的幼雞的一種急性高度接觸性傳染病[1]。幼雞感染后，可導(dǎo)致嚴(yán)重的、長期的免疫抑制，并可誘發(fā)多種疾病或使多種疫苗免疫失敗，因此常造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。在臨床中雞群接種雞傳染性法氏囊病疫苗后，有時還會出現(xiàn)雞傳染性法氏囊病病例，其主要原因是疫苗保護(hù)率低和某些免疫抑制因素。本試驗旨在研究增免散對雞免疫功能的調(diào)節(jié)作用，為獸醫(yī)臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 1日齡海蘭褐蛋公雞200只，購自邢臺市昌盛種雞孵化場。

1.2 藥品與試劑 法氏囊病病毒抗體ELISA檢測試劑盒，購自上海一研生物科技有限公司；雞IL-2、TNF-α ELISA檢測試劑盒，均購自北京百奧萊博科技有限公司；雞傳染性法氏囊病毒弱毒疫苗，為瑞譜(保定)生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器設(shè)備 電子天平，上海浦春計量儀器有限公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀，上海三科儀器有限公司生產(chǎn)。

1.4 增免散組方與制備 增免散方劑組成如下：紫錐菊500 g，黃芪500 g，當(dāng)歸300 g，石菖蒲200 g，甘草100 g，以上藥材購自石家莊樂仁堂大藥房，經(jīng)鑒定符合藥典規(guī)范的道地中藥材。按上述比例粉成粗粉過篩，混勻裝袋，即得。

1.5 試驗動物分組 1日齡海蘭褐蛋雞正常飼養(yǎng)至6日齡，選體重、發(fā)育及健康狀況接近的200只，隨機(jī)等分為A，B，C，D四個大組，每組50 只。其中增免散分為3個劑量組：A 組為低劑量組(0.5 %)，B 組為中劑量組(1 %)，C 組為高劑量組(1.5 %)，D 組為對照組，對照組為正常免疫不用藥組。6 日齡雛雞開始飼喂添加藥物的飼料，連續(xù)7 d。自由飲水，常規(guī)飼養(yǎng)管理。13日齡進(jìn)行法氏囊弱毒苗接種免疫，2倍劑量滴鼻點眼。

1.6 免疫器官指數(shù)的測定 在21、28、35日齡和42日齡，每組隨機(jī)取5只雞剖取法氏囊、脾臟，應(yīng)用電子天平稱重，并與相應(yīng)的體重進(jìn)行比較，計算脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)。

計算公式：脾臟指數(shù)=脾臟重(mg)/體重(g)；法氏囊指數(shù)=法氏囊重(mg)/體重(g)

1.7 ELISA測定外周血中IBDV抗體 在20、27日齡和34 日齡，每組隨機(jī)取10 只雞，翅靜脈采血，3 000 r/min離心15 min，吸取血清檢測IBDV 抗體。按照試劑盒說明書操作，試劑盒反應(yīng)終止后，在酶標(biāo)儀450 nm波長處讀取吸光度(Optical density,OD)值，利用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各組外周血中IBDV抗體效價。

1.8 ELISA測定外周血中細(xì)胞因子IL-2、TNF-α的含量 在20、27日齡和34日齡根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的性質(zhì)，選用種屬特異性的酶聯(lián)免疫分析試劑盒(IL-2、TNF-α)測定血清中的細(xì)胞因子的含量。按照試劑盒說明書操作，試劑盒反應(yīng)終止后，酶標(biāo)儀讀取吸光度OD值，利用己知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各細(xì)胞因子含量。

2 結(jié)果

2.1 免疫器官指數(shù)測定 不同日齡，各用藥組脾臟指數(shù)均顯著高于對照組，說明增免散能促進(jìn)脾臟的成長發(fā)育。表1中各用藥組分別和對照組差異比較，在21、28日齡和42日齡極顯著高于對照組(P<0.01)，在35日齡時差異不顯著(P>0.05)。

表1 不同日齡不同劑量脾臟指數(shù)比較

表2表明，所有用藥組法氏囊指數(shù)均顯著高于對照組，說明增免散能促進(jìn)法氏囊的成長發(fā)育。在21日齡、28日齡、35日齡、42日齡，各用藥組法氏囊指數(shù)均極顯著高于對照組(P<0.01)，以B組中劑量組最為明顯。

表2 不同日齡不同劑量法氏囊指數(shù)比較

2.2 外周血中IBDV抗體測定 由表3可以看出，由于13 日齡免疫雞傳染性法氏囊病弱毒苗，在肉雞體內(nèi)存在的仍然是母源抗體，所以同對照組相比，不同劑量組之間的抗體水平?jīng)]有差異。20 日齡時飼喂藥物的3個劑量組產(chǎn)生的抗體均明顯高于對照組D(P<0.01)；中、高劑量組B、C 組抗體顯著高于低劑量組A(P<0.01)。中、高劑量組間沒有差異；在27 日齡和34 日齡，用藥劑量組產(chǎn)生的抗體均明顯高于對照組(P<0.01)，而且中、高劑量組同樣顯著高于低劑量組，中、高劑量組間沒有差異。在34 日齡時用藥組同樣顯著高于對照組(P<0.01)，而中、高劑量組同樣顯著高于低劑量組(P<0.01)。

表3 不同日齡不同劑量各組IBDV抗體滴度(log10)比較Table 3 Comparison of IBDV anitibody titer of different ages and doses

2.3 外周血中細(xì)胞因子IL-2、TNF-α的含量測定結(jié)果 由表4可知，用藥組外周血中IL-2的含量都明顯高于對照組，其中B組中劑量組含量最高，持續(xù)的時間最久，在免疫后4周內(nèi)IL-2的含量一直顯著高于對照組(P<0.01)，并且持續(xù)時間要長于其余各組。

表4 不同日齡不同劑量各組產(chǎn)生IL-2比較Table 4 Comparison of IL-2 generate in groups of different ages and doses (pg/mL)

表5表明，用藥組外周血中TNF-α的含量極顯著高于對照組(P<0.01)。在21日齡，B組TNF-α含量最高，各組之間差異極顯著(P<0.01)；在28日齡，3個用藥組之間差異不顯著(P>0.05)；在35日齡、42日齡，仍然是B組TNF-α含量最高，各組之間差異極顯著(P<0.01)。

表5 不同日齡不同劑量各組產(chǎn)生TNF-α比較Table 5 Comparison of TNF-α generatea in groups of different ages and doses (pg/mL)

3 討論

法氏囊是禽類重要的中樞免疫器官，是誘導(dǎo)淋巴干細(xì)胞成為免疫活性細(xì)胞，并將其輸送給外周免疫器官的場所。來自于骨髓的多功能干細(xì)胞，經(jīng)血流進(jìn)法氏囊后分化成為細(xì)胞，經(jīng)淋巴和血液循環(huán)移至外周免疫器官的非胸腺依賴區(qū)并繼續(xù)增殖，參與體液免疫。如雛雞法氏囊發(fā)育良好，則有利于抗體水平的提高[4]。脾臟是體內(nèi)最大的免疫器官，是產(chǎn)生抗體的主要基地。在本次試驗中，從免疫器官指數(shù)測定結(jié)果可以看出，各用藥階段脾臟指數(shù)、法氏囊指數(shù)均明顯高于對照組，說明各加藥組均能促進(jìn)脾臟和法氏囊的成長發(fā)育，且中劑量組(B組)作用最顯著，時間最持久。各用藥組在使用藥物后第2周開始表現(xiàn)出藥效，A組在用藥2周后，也表現(xiàn)出對脾臟和法氏囊發(fā)育的促進(jìn)作用，但是持續(xù)作用時間不長，可能是劑量太小的原因。

IBDV主要以B淋巴細(xì)胞為靶細(xì)胞，引起法氏囊B 淋巴細(xì)胞的凋亡，被認(rèn)為是造成免疫抑制的主要原因[5]。IBDV主要感染未成熟的淋巴細(xì)胞或淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞，由于法氏囊是淋巴細(xì)胞成熟的重要器官，雞在感染后，淋巴濾泡內(nèi)的淋巴細(xì)胞大量裂解死亡，網(wǎng)狀細(xì)胞呈凋亡過程，最終導(dǎo)致法氏囊等器官萎縮，或是淋巴細(xì)胞功能降低持續(xù)時間較長，同時血清、淚液、氣管液、膽汁、腸液中IgM、IgG、IgA含量明顯下降，從而引起免疫抑制，同時對淋巴細(xì)胞也有一定損傷作用[2,6]。在本次抗體檢測試驗研究中，應(yīng)用增免散后，各用藥組的抗體水平有明顯的提高，特別是B組，說明B組在劑量上已經(jīng)達(dá)到了最佳的藥物效果。試驗表明，增免散有明顯提高針對IBDV抗體水平，其作用效果可能是增免散中的某種成分保護(hù)了法氏囊中的淋巴細(xì)胞，免受病毒的影響。國外有研究表明，紫錐菊提取物能夠提

高禽類特異性抗體水平，也能提高正常小鼠和免疫抑制小鼠對綿羊血紅細(xì)胞的抗體水平[7-8]，這與本試驗結(jié)果相一致。

T淋巴細(xì)胞及其所分泌的IL-2在機(jī)體特異性免疫應(yīng)答中起核心作用[9]。IL-2分泌水平高低可以反映機(jī)體的免疫機(jī)能，特別是細(xì)胞免疫水平。TNF是一類能直接造成腫瘤細(xì)胞死亡的細(xì)胞因子。TNF-α主要由巨嗜細(xì)胞產(chǎn)生，可介導(dǎo)白細(xì)胞積聚與炎癥部位，激活炎性白細(xì)胞，殺死微生物刺激單核細(xì)胞及其他種類細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子增強(qiáng)免疫反應(yīng)，殺死或抑制某些腫瘤細(xì)胞。從本試驗中，從21日齡開始，用藥組外周血中IL-2、TNF-α的含量顯著高于對照組，提示增免散能顯著提高機(jī)體細(xì)胞免疫水平。

綜上所述，增免散對IBDV疫苗的免疫效果有顯著促進(jìn)作用，是一種良好的免疫增強(qiáng)劑。其增強(qiáng)免疫效果途徑是從體液免疫和細(xì)胞免疫兩方面產(chǎn)生作用，對特異性抗原抗體有促進(jìn)作用，對非特異性的細(xì)胞免疫也有促進(jìn)作用，且以中劑量組(1 %)效果最佳，為臨床上防控傳染性法氏囊病提供新的思路與方法。