楊大艷 陳其青 鐘婷婷 張 敏 陳 艷 謝 琳 王明華 景香香

研究［1］表明，肝癌的形成與演變經(jīng)歷了長(zhǎng)期復(fù)雜的過(guò)程，且受較多因素影響，其實(shí)質(zhì)為多基因的病癥。所以，基于基因?qū)用婵紤]，利用載體將靶基因?qū)胫翙C(jī)體內(nèi)，在靶組織內(nèi)特異性地以可調(diào)控的方式進(jìn)行表達(dá)，不會(huì)對(duì)正常肝細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)生影響，以達(dá)到相應(yīng)的治療效果［2］?；蛑委熭^傳統(tǒng)治療方法具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［3］，在超聲聚焦輻照的作用下，細(xì)胞膜會(huì)產(chǎn)生空化效應(yīng)與聲孔效應(yīng)等物理變化［4］，可協(xié)助基因及藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，低強(qiáng)度聚焦超聲（LIFU）輻照可能成為最優(yōu)的基因轉(zhuǎn)染方法。本實(shí)驗(yàn)擬以葉酸（FA）進(jìn)行表面修飾，構(gòu)建一種載有Survivin啟動(dòng)子聯(lián)合皰疹病毒Ⅰ型胸苷激酶自殺基因［5］的液態(tài)氟碳納米粒，并觀(guān)察其表征及靶向性，為進(jìn)一步提高多功能全氟碳納米粒在腫瘤診斷及治療中的發(fā)展提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料與試劑

羧基端乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA，乳酸與羥基乙酸聚合比例50∶50，分子量25 000，濟(jì)南岱罡生物工程有限公司）；FA（美國(guó) Sigma公司）；pEGFP-N1（上海生工生物工程有限公司）；S-HSV1-TK（上海生工生物工程有限公司合成）；全氟戊烷（PFP，北京百靈威科技有限公司）；多聚賴(lài)氨酸（美國(guó)Sigma公司）；聚乙二醇（PEG，北京鍵凱科技有限公司）；聚乙烯醇（PVA，美國(guó)阿拉丁試劑）；二氯甲烷（重慶川東化工集團(tuán)）；瓊脂糖（重慶惠利試劑公司）；PBS緩沖液（美國(guó)Sigma公司）；DiI紅色熒光探針（碧云天生物技術(shù)研究所）；FITC標(biāo)記的小鼠抗葉酸IgG（英國(guó)Abcam公司）；LB培養(yǎng)基（美國(guó)Sigma公司）；HepG2細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所贈(zèng)予；天根質(zhì)粒抽提試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。

二、實(shí)驗(yàn)儀器

超聲聲振儀（Vcx-130型，美國(guó)Sonic公司）；超微量分光光度計(jì)（NanoDrop2000/2000C，美國(guó)Thermo Scientific公司）；百勝M(fèi)yLab 90彩色多普勒超聲診斷儀；低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；磁力攪拌器（上海安亭電子儀器廠(chǎng)）；光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（S 4800，日本日立公司）；馬爾文納米粒度電位分析儀（Zetasizer Nano ZS 90，英國(guó)Malvern有限公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）；共聚焦顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；雙探頭LIFU儀（重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所研制）。

三、實(shí)驗(yàn)方法

（一）構(gòu)建目標(biāo)質(zhì)粒

在NCBI基因庫(kù)中查詢(xún)Survivin Promoter堿基序列號(hào)為NC-000017.11，HSV1-TK堿基序列號(hào)為NC-001806.1，將兩者結(jié)合后與質(zhì)粒載體pEGFP-N1連接，得到所需目標(biāo)質(zhì)粒S-HSV1-TK。

（二）質(zhì)粒的提取

取帶有S-HSV1-TK質(zhì)粒的感受態(tài)菌接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃持續(xù)震蕩，培養(yǎng)過(guò)夜（150 r/min），按照天根質(zhì)粒抽提試劑盒說(shuō)明進(jìn)行質(zhì)粒抽提，使用超微量分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)質(zhì)粒濃度，調(diào)整質(zhì)粒濃度為600 ng/μl備用。

（三）載質(zhì)粒的可相變靶向納米造影劑的制備及表征

1.靶向膜材料FA-PLGA的制備：采用碳乙亞胺法先將PEG與PLGA相連，然后再將FA連接至PEG-PLGA，得到靶向膜材料FA-PLGA，用于后續(xù)微球的制備。

2.包裹液態(tài)氟碳靶向多模態(tài)納米級(jí)超聲造影劑的制備：稱(chēng)取50 mg FA-PLGA，加入2 ml二氯甲烷，水浴2 min促溶，冰浴降溫待用。然后采用雙乳法制備納米粒，即加入200 μl PFP，超聲聲振儀輸出功率45%，間歇5 s模式，震蕩2.5 min，加入4%PVA，繼續(xù)震蕩2.5 min，加入2%異丙醇，放入磁珠后，冰浴條件下磁力攪拌6 h，10～15 r/min。取出磁珠后將混合液低溫離心，10 000 r/min，離心5 min，雙蒸水清洗3次，向沉淀內(nèi)加少量雙蒸水重懸備用。

3.靶向陽(yáng)離子納米粒的制備：將靶向包裹液態(tài)氟碳的納米粒與0.1 mg/ml濃度的多聚賴(lài)氨酸以1∶1的體積比在冰浴條件下，搖床120 r/min共同孵育4 h，離心（5000 r/min）3 min后取沉淀，得到靶向陽(yáng)離子納米粒，將其置于光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡下觀(guān)察外觀(guān)、形態(tài)、結(jié)構(gòu)及分散度；使用馬爾文納米粒度電位分析儀和電位測(cè)量?jī)x測(cè)定其平均粒徑和表面電位。

4.靶向陽(yáng)離子納米粒與質(zhì)粒的連接：將上述制備的靶向陽(yáng)離子納米粒與質(zhì)粒按照4∶1體積比，在EP管內(nèi)進(jìn)行混合，常溫環(huán)境下孵育15 min，然后低速離心5 min。下層為載質(zhì)粒的納米粒S-HSV1-TK/PFP@FAPLGA，上層為游離DNA。取2 μl載有質(zhì)粒的靶向陽(yáng)離子納米粒溶液，置于超微量分光光度計(jì)中測(cè)定納米粒內(nèi)質(zhì)粒的濃度。

（四）體外相變實(shí)驗(yàn)

1.鏡下觀(guān)察LIFU輻照所致相變：在載玻片上加入100 μl載基因液態(tài)氟碳靶向納米粒S-HSV1-TK/PFP@FA-PLGA，選擇厚度約15 mm的水囊，將其放置于蓋玻片上，超聲輻照功率5 W，于輻照時(shí)間點(diǎn)1 min、3 min、5 min在顯微鏡下觀(guān)察S-HSV1-TK/PFP@FAPLGA液氣相變情況。

2.超聲造影觀(guān)察LIFU輻照所致相變：制備4%瓊脂糖凝膠模型，20 g瓊脂糖凝膠粉加入500 ml雙蒸水，將其放置于微波爐內(nèi)加熱，攪拌均勻后在凝膠內(nèi)插入EP管，將其固定，直至冷卻凝固得到帶孔的凝膠模型。將納米粒滴濃度調(diào)至50 mg/ml，加入凝膠孔內(nèi)，使用LIFU輻照，采集輻照后1 min、3 min、5 min聲像圖。

（五）體外靶向性實(shí)驗(yàn)

1.靶向納米粒連靶效率的檢測(cè)：在靶向膜材料FA-PLGA的制備過(guò)程中加入DiI染料，使PLGA發(fā)紅色熒光。制備靶向納米粒后，將小鼠抗葉酸IgG與靶向納米粒濃度以1∶500的比例在冰浴條件下，搖床120 r/min，孵育4 h，離心取沉淀后重懸，以1∶100的濃度加入FITC，在同樣冰浴條件下以120 r/min的速度置于搖床，繼續(xù)孵育1 h，離心、洗滌，收集納米粒。將收集的納米粒取100 μl送流式細(xì)胞儀雙熒光檢測(cè)，于共聚焦顯微鏡下觀(guān)察連靶情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)納米粒連靶率。

2.體外納米粒與HepG2細(xì)胞尋靶實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)的密度接種于六孔板內(nèi)，于孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，分為靶向組和非靶向組，每組3個(gè)復(fù)孔，分別加入濃度為100 μg/ml的靶向納米粒和非靶向納米粒與培養(yǎng)基混合液1 ml，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，PBS緩沖液反復(fù)沖洗3遍，于共聚焦顯微鏡下觀(guān)察納米粒與細(xì)胞的黏附情況。

結(jié) 果

一、納米粒的表征

顯微鏡下見(jiàn)納米粒大小均一，分散度好；DiI染色后熒光顯微鏡下見(jiàn)紅色熒光；掃描電鏡見(jiàn)納米粒呈圓形，形態(tài)好；納米粒平均粒徑（200.50±66.34）nm，平均表面電位（37.40±7.08）mV。見(jiàn)圖1～5。

二、靶向陽(yáng)離子納米粒載基因量檢測(cè)

超微量分光光度計(jì)測(cè)量納米粒內(nèi)質(zhì)粒濃度為5 ng/μl，即靶向陽(yáng)離子納米粒載基因濃度為 5 ng/μl。將GEL-RED染色后的質(zhì)粒與陽(yáng)離子納米粒孵育，共聚焦顯微鏡下觀(guān)察可見(jiàn)納米粒表面攜帶紅色熒光的質(zhì)粒，載質(zhì)粒量滿(mǎn)意（圖6）。

三、LIFU對(duì)納米粒輻照情況

光鏡下觀(guān)察顯示，隨著LIFU輻照時(shí)間增加，越來(lái)越多的納米粒相變，體積由納米級(jí)變成微米級(jí)（圖7）；超聲造影亦可見(jiàn)超聲造影信號(hào)隨著時(shí)間增加而增加，回聲由弱逐漸增強(qiáng)，LIFU輻照5 min時(shí)可采集到明顯的造影成像（圖8）。

四、納米粒連靶率及體外尋靶能力

流式細(xì)胞儀雙熒光檢測(cè)顯示同時(shí)發(fā)綠色熒光與紅色熒光的納米粒約占95%，即納米粒的連靶率約為95%（圖9）。共聚焦顯微鏡下觀(guān)察示，帶紅色熒光的納米粒與帶綠色熒光的FA重合度較高，說(shuō)明納米粒有較高的連靶率（圖10）。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，共聚焦顯微鏡下觀(guān)察示靶向納米粒較非靶向納米粒更多地黏附在HepG2細(xì)胞周邊（圖11），說(shuō)明其對(duì)HepG2細(xì)胞靶向性明顯。

討 論

腫瘤微血管管壁孔徑最大值多為380～780 nm［6］。目前常用的超聲造影劑微泡直徑平均為2～4 mm，可以進(jìn)行肺循環(huán)，但無(wú)法穿過(guò)血管內(nèi)皮［7］，納米級(jí)造影劑具有較強(qiáng)的穿透力，可以穿過(guò)血管內(nèi)皮，達(dá)到血管外顯影的目的［8-9］，且納米粒作為載體能夠改善治療藥物的親水性及其在體內(nèi)的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)循環(huán)時(shí)間［10］。此外，關(guān)于液態(tài)氟碳納米粒作為靶向藥物載體方面的研究不斷深入，其可以通過(guò)液-氣相轉(zhuǎn)變，使造影劑從納米級(jí)向微米級(jí)轉(zhuǎn)變，起到增強(qiáng)超聲顯像的作用［11］，使納米級(jí)造影劑能穿過(guò)腫瘤增大的血管內(nèi)皮間隙，并在腫瘤細(xì)胞內(nèi)成像［12-13］。本實(shí)驗(yàn)制備的造影劑包裹液態(tài)氟碳PFP，低溫狀態(tài)下粒徑控制在納米級(jí)，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，納米粒經(jīng)LIFU輻照后，粒徑變?yōu)槲⒚准?jí)，可以增強(qiáng)超聲造影顯像。

靶點(diǎn)選擇是分子影像學(xué)的研究重點(diǎn)，當(dāng)前研究［14］多集中于使用單克隆抗體或多肽等對(duì)藥物或造影劑表面進(jìn)行靶向修飾，但蛋白分子量大，組織穿透力弱，連接手段復(fù)雜且不穩(wěn)定，因此在實(shí)際應(yīng)用中受到限制。FA是天然存在的小分子物質(zhì)，幾乎無(wú)免疫原性，且其受體在大部分惡性腫瘤組織，包括肝癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌及乳腺癌等組織中高度表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)將腫瘤細(xì)胞表面的FA受體作為靶點(diǎn)，在制備納米粒時(shí)，先將FA連接在膜材料表面，再制備納米球，提高了FA的利用率，也增加了納米粒的連靶率，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示納米粒連靶率達(dá)95%；體外細(xì)胞尋靶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自制的靶向納米粒較非靶向納米粒對(duì)肝癌細(xì)胞具有更明顯的靶向功能。

肝癌實(shí)質(zhì)為多基因的病癥［1］，基因治療具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。超聲聚焦輻照可使細(xì)胞膜產(chǎn)生物理變化，有助于基因及藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，可能成為最具前景的基因轉(zhuǎn)染方法。本實(shí)驗(yàn)成功將載有肝癌的自殺基因的質(zhì)粒通過(guò)陽(yáng)離子納米粒的吸附作用，連接在了納米粒表面。但該納米粒在LIFU輻照下進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率及效果仍需進(jìn)一步探索。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)制備的載自殺基因的靶向液態(tài)氟碳納米粒，性質(zhì)穩(wěn)定，靶向性好，且表面成功攜帶了質(zhì)粒，為今后研究質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及腫瘤的治療奠定了良好基礎(chǔ)。