李聞，鄭寶璐，于愛(ài)萍，張維，張?jiān)伱?，劉廣文，劉小暢，蘇旭，李曉燕(天津市疾病預(yù)防控制中心病原生物實(shí)驗(yàn)室，天津 300011)

在國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中，新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)的確診標(biāo)準(zhǔn)在原有核酸檢測(cè)的基礎(chǔ)之上增加了抗體檢測(cè)[1]。理論上特異性IgM抗體升高通常提示急性感染，表明機(jī)體已經(jīng)暴露于病原體，產(chǎn)生對(duì)急性感染的首次應(yīng)答。IgM抗體多在發(fā)病3～5 d后開(kāi)始出現(xiàn)陽(yáng)性，一般存在2～3周，可用于感染的早期篩查。特異性IgG抗體升高通常提示既往感染。IgG抗體出現(xiàn)較IgM晚，可以存在較長(zhǎng)時(shí)間，恢復(fù)期IgG抗體滴度較急性期有4倍及以上增高[2-3]。本研究基于鏈霉親和素-磁微粒的間接法化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，定量檢測(cè)COVID-19患者血清/血漿樣本中的新型冠狀病毒(SARS-CoV-2) IgM和IgG抗體，評(píng)估特異性IgM和IgG抗體的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1研究對(duì)象 收集2020 年1月20日至2020 年3月1日天津市疾病預(yù)防控制中心333例患者的血清樣本(血清樣本共360份)，其中，疾病組包括COVID-19確診患者88例(血清樣本115份)，男性38例，女性50例，平均年齡40歲；對(duì)照組245例(血清樣本245份)，男性130例，女性115例，平均年齡37歲。入組及排除標(biāo)準(zhǔn)：疾病組為核酸檢測(cè)陽(yáng)性；對(duì)照組為排除SARS-CoV-2感染的患者(核酸檢測(cè)陰性)。

1.2試劑與儀器 新型冠狀病毒IgM和IgG抗體檢測(cè)試劑(磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法，天津丹娜生物公司)，新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法，上海伯杰公司)；SMART 6500全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀(科斯邁公司)，7500 FAST型熒光定量PCR儀(ABI公司)。

1.3標(biāo)本采集 以COVID-19確診患者開(kāi)始出現(xiàn)臨床癥狀(發(fā)熱或咳嗽)計(jì)為發(fā)病。采集不同病程血清樣本，包括早期(發(fā)病后1～7 d)血清樣本38份，中期(發(fā)病后8～14 d)血清樣本27份，后期(發(fā)病≥15 d)血清樣本50份。其中有25例患者收集2～3個(gè)病程的血清樣本進(jìn)行SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體的連續(xù)監(jiān)測(cè)。

1.4方法 用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體，檢測(cè)的抗原位點(diǎn)是SARS-CoV-2核衣殼蛋白和棘突蛋白，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，每次實(shí)驗(yàn)均同時(shí)檢測(cè)陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。計(jì)算待測(cè)樣本的指數(shù)(I)=待測(cè)樣本發(fā)光強(qiáng)度值/(陽(yáng)性質(zhì)控品發(fā)光強(qiáng)度值的平均值×0.2+陰性質(zhì)控品發(fā)光強(qiáng)度值的平均值)。陽(yáng)性質(zhì)控品的I值為4.0～5.5，如I<1.0，則判定為陰性；如I≥1.0，則判定為陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 24.0軟件對(duì)資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行二項(xiàng)式數(shù)據(jù)擬合，計(jì)量資料組間比較采用秩和檢驗(yàn)(Mann-WhitneyU檢驗(yàn))。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體在COVID-19不同病程中的陽(yáng)性率 SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測(cè)對(duì)處于COVID-19病程早期的確診樣本陽(yáng)性率為65.79%和52.63%，病程中期和后期的樣本IgM和IgG抗體陽(yáng)性率分別為92.59%、88.89%和96.00%、98.00%，見(jiàn)表1。

表1 IgM和IgG抗體檢測(cè)在COVID-19不同病程中的陽(yáng)性率

2.2SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體及聯(lián)合檢測(cè)的臨床檢測(cè)性能 按照病例數(shù)統(tǒng)計(jì)分析抗體的臨床檢測(cè)性能，同一受試者不同病程的多個(gè)樣本僅取一次陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)時(shí)，IgM和IgG抗體在COVID-19患者中檢測(cè)的敏感性分別為90.91%(80/88)和88.64%(78/88)，特異性均為100%。IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)敏感性和特異性可高達(dá)96.59%(85/88)和100%，與核酸檢測(cè)的總符合率為99.10%(330/333)。

2.3SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體水平在不同病程間的比較 病程中期、后期IgM、IgG抗體水平(I值)與早期相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)，中期、后期之間IgG抗體水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而中期和后期IgM抗體水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.086 6)，見(jiàn)表2。

表2 不同病程間IgM和IgG抗體水平的比較

2.4COVID-19患者SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體連續(xù)監(jiān)測(cè)的臨床價(jià)值 觀察COVID-19患者IgM和IgG抗體水平動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 IgM抗體水平在患者32 d的病程中呈現(xiàn)先升高、后下降的趨勢(shì)；而IgG抗體水平隨著病程的發(fā)展逐漸升高，并長(zhǎng)時(shí)間維持在一個(gè)較高的水平，見(jiàn)圖1A。

對(duì)3個(gè)不同病程均有采樣的2例患者進(jìn)行IgM和IgG抗體水平分析，1號(hào)患者早期IgM和IgG抗體檢測(cè)均為陰性，中期和后期為陽(yáng)性，IgM抗體水平在中期最高，后期下降，而IgG抗體水平在后期顯著升高。2號(hào)患者早期、中期、后期IgM和IgG抗體檢測(cè)均為陽(yáng)性，IgM和IgG抗體水平均呈緩慢升高，在中期和后期IgG抗體水平均高于IgM抗體，見(jiàn)圖1B。

連續(xù)觀察25例COVID-19患者IgM和IgG抗體水平隨病程的變化趨勢(shì)，7例患者在中期和后期進(jìn)行了IgM抗體的檢測(cè)，其中有4例患者IgM抗體水平在病程后期相比于中期呈下降的趨勢(shì)，見(jiàn)圖1C。25例患者IgG抗體水平在病程后期相比于早期和中期均呈上升的趨勢(shì)，見(jiàn)圖1D。

3 討論

徐萬(wàn)洲等[4]研究SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體對(duì)COVID-19檢測(cè)的敏感性分別為70.24%和96.10%，特異性分別為96.20%和92.41%，抗體與核酸檢測(cè)的總符合率為88.03%。其中，19例核酸陰性但臨床診斷的COVID-19患者中，16例IgM抗體檢測(cè)陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)84.21%，18例IgG抗體檢測(cè)陽(yáng)性，陽(yáng)性率達(dá)94.74%。由此可見(jiàn)，抗體檢測(cè)可以有效地彌補(bǔ)核酸檢測(cè)的不足，兩者聯(lián)合檢測(cè)提高檢出率。在本研究中有4例患者在發(fā)病后1周內(nèi)同時(shí)進(jìn)行核酸和抗體檢測(cè)，核酸檢測(cè)均為陰性，但2例患者IgM抗體檢測(cè)陽(yáng)性，2例患者IgG抗體檢測(cè)陽(yáng)性。隨后4例患者又進(jìn)行1～3次不等的核酸復(fù)測(cè)，最后均核酸檢測(cè)陽(yáng)性，確診為COVID-19。分析前期出現(xiàn)核酸多次檢測(cè)陰性可能受檢測(cè)窗口期、樣本采集、運(yùn)輸、保存等因素影響。抗體聯(lián)合檢測(cè)可以有效地彌補(bǔ)核酸檢測(cè)的局限性，顯著提高COVID-19患者檢測(cè)的敏感性。

Zhao等[5]觀察核酸和抗體檢測(cè)在COVID-19不同病程的臨床價(jià)值，結(jié)果顯示病程早期核酸檢測(cè)的敏感性最高，達(dá)66.7%，而抗體檢測(cè)敏感性僅有38.3%；在病程中期，IgM和IgG抗體檢測(cè)的敏感性為73.3%和54.1%，高于核酸檢測(cè)的敏感性54.0%；在病程后期，IgM和IgG的敏感性分別為94.3%和79.8%，相比之下，核酸檢測(cè)的陽(yáng)性率只有45.5%。本研究與其一致，COVID-19患者SARS-CoV-2 IgM抗體的陽(yáng)性率在病程早期和中期為65.79%和92.59%，均高于IgG抗體陽(yáng)性率(52.63%和88.89%)，當(dāng)COVID-19患者處于病程的后期時(shí)，IgG陽(yáng)性率顯著升高，達(dá)到98.00%。

進(jìn)一步分析不同病程患者 IgM和IgG的抗體水平，結(jié)果顯示IgM抗體水平在病程早期和中期呈上升趨勢(shì)，在中期時(shí)I值最高(4.25±2.90)，當(dāng)病程進(jìn)入后期，IgM抗體水平呈下降趨勢(shì)，I值為3.23±2.20。而IgG抗體水平在病程早期、中期及后期呈逐漸升高的趨勢(shì)，尤其在病程的后期時(shí)I值最高為9.22±4.62，與早期(0.94±0.7)相比呈現(xiàn)大于4倍以上升高。觀察COVID-19患者32 d病程中IgM和IgG抗體水平的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 IgM抗體水平呈現(xiàn)先升高、后下降的趨勢(shì)；隨著病程的發(fā)展IgG抗體水平逐漸升高，并可長(zhǎng)時(shí)間維持在一個(gè)較高的水平。這與機(jī)體免疫應(yīng)答規(guī)律相一致：IgM抗體先升高后降低，IgG抗體出現(xiàn)晚于IgM抗體，但可較長(zhǎng)時(shí)間存在。3個(gè)不同病程均有采樣的2例患者抗體水平分析結(jié)果提示，不同患者抗體產(chǎn)生可能存在差異，1號(hào)患者在病程早期無(wú)抗體產(chǎn)生，此時(shí)核酸檢測(cè)更有價(jià)值，2號(hào)患者在病程早期就產(chǎn)生抗體，這可能因?yàn)榛颊吲R床癥狀不明顯，實(shí)際病程要長(zhǎng)于主訴病程，在入院時(shí)體內(nèi)已產(chǎn)生抗體。本研究中有4例COVID-19患者IgG和IgM抗體檢測(cè)始終為陰性，這可能與患者自身的免疫狀態(tài)有關(guān)。COVID-19患者伴有免疫缺陷或低下(長(zhǎng)期使用免疫抑制劑)時(shí)，抗體的產(chǎn)生可能會(huì)受影響，這些患者的診斷需結(jié)合臨床和其他診斷方法綜合考慮[6]。

目前，已獲批的SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體試劑盒主要包括膠體金法和化學(xué)發(fā)光法2種方法。武漢大學(xué)中南醫(yī)院對(duì)化學(xué)發(fā)光法和膠體金法檢測(cè)SARS-CoV-2特異性抗體進(jìn)行了研究比較，發(fā)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光法具有較高的臨床特異性，能達(dá)到100%[7]，這與本文的研究結(jié)果一致。

綜上，SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體化學(xué)發(fā)光法聯(lián)合檢測(cè)敏感性高，可作為COVID-19有效的輔助診斷，彌補(bǔ)核酸檢測(cè)的不足。抗體與核酸聯(lián)合檢測(cè)可顯著提高COVID-19患者的檢出率，降低漏診率，在病程監(jiān)測(cè)和轉(zhuǎn)歸方面具有重要意義。