盧婷，陳雨欣，沈瀚(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京 210009)

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)具有高傳染性、高隱匿性和高致病性的特點(diǎn)[1]，引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)主要癥狀為發(fā)熱、咳嗽和呼吸困難，重癥患者多發(fā)展成呼吸窘迫綜合征、膿毒癥、多功能器官衰竭等[2]，早發(fā)現(xiàn)、早治療是控制疫情的關(guān)鍵。臨床上主要采用商品化的試劑盒進(jìn)行核酸檢測(cè)和血清學(xué)抗體檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)是診斷SARS-CoV-2的確診方式[2]，但是目前核酸檢測(cè)假陰性率較高，與部分患者臨床癥狀不符，給臨床診治帶來困擾。本研究通過留取確診患者多種樣本(包括鼻咽拭子、糞便、尿液、血液)進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)及病毒血清抗體檢測(cè)，旨在提高患者病毒檢出率，盡快確診。

1 資料和方法

1.1研究對(duì)象 患者1，男，35歲，主訴“咽部不適”，2020年2月3日出現(xiàn)頭疼、惡心欲吐，2月4日入本院發(fā)熱門診就診，當(dāng)日檢測(cè)咽拭子SARS-CoV-2核酸陽性，2月5日復(fù)檢咽拭子SARS-CoV-2核酸陽性，結(jié)合影像學(xué)、臨床癥狀和核酸檢測(cè)結(jié)果確診為COVID-19，2月5日轉(zhuǎn)入定點(diǎn)醫(yī)院治療。

患者2，男，56歲，主訴“咳嗽、發(fā)熱1 d”，2020年1月30日曾與武漢返寧人員有接觸史，2月1日出現(xiàn)咳嗽、發(fā)熱癥狀，2月2日入本院發(fā)熱門診治療，溫度38.2 ℃，當(dāng)日檢測(cè)咽拭子SARS-CoV-2核酸陽性，2月3日復(fù)檢咽拭子SARS-CoV-2核酸陽性，結(jié)合臨床表現(xiàn)、接觸史及核酸檢測(cè)結(jié)果確診為COVID-19，2月3日轉(zhuǎn)入定點(diǎn)醫(yī)院治療。

患者3，男，27歲，主訴“發(fā)熱2 d”，2020年1月28日與武漢返寧人員有接觸史，1月29日出現(xiàn)發(fā)熱，2月1日入發(fā)熱門診就診，溫度38.0 ℃，當(dāng)日檢測(cè)咽拭子SARS-CoV-2核酸陽性，2月2日咽拭子SARS-CoV-2核酸復(fù)檢陽性，結(jié)合臨床表現(xiàn)、接觸史及核酸檢測(cè)結(jié)果確診為COVID-19，2月2日轉(zhuǎn)入定點(diǎn)醫(yī)院治療。

患者4，女，62歲，主訴“發(fā)熱5 d”，2020年2月2日入發(fā)熱門診就診，溫度38.5 ℃，當(dāng)日咽拭子SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽性，2月3日咽拭子SARS-CoV-2核酸復(fù)檢陽性，結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像學(xué)及核酸檢測(cè)結(jié)果確診為COVID-19， 2月3日轉(zhuǎn)入定點(diǎn)治療醫(yī)院治療。

1.2標(biāo)本采集 采集咽拭子SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽性的4名COVID-19患者的不同類型標(biāo)本，包括鼻拭子、糞便、尿液、血液，所有標(biāo)本在咽拭子SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽性后的24 h內(nèi)采集完畢。咽拭子、鼻拭子、尿液保存在病毒采樣管(包含生理鹽水和RNA酶抑制劑)內(nèi)；糞便標(biāo)本取花生米大小量放入病毒采樣管，渦旋震蕩2次，每次15 s，2 000 r/min離心5 min；空腹?fàn)顟B(tài)下抽取患者5 mL血液保存在有分離膠的采血管內(nèi)，3 000 r/min離心5 min，分離血清后備用。

1.3儀器與試劑 Cobas LightCycler480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)，新型冠狀病毒(2019)核酸檢測(cè)試劑盒和配套核酸提取液(碩世公司)，i Flash 3000-H化學(xué)發(fā)光免疫分析儀以及配套新型冠狀病毒免疫球蛋白IgM和IgG抗體化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒(深圳亞輝龍公司)。

1.4核酸提取和擴(kuò)增 上述標(biāo)本采用核酸提取和檢測(cè)試劑盒進(jìn)行RNA提取和擴(kuò)增，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。將反應(yīng)管放入Cobas LightCycler480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀擴(kuò)增，擴(kuò)增參數(shù)：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min；95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，55 ℃ 40 s退火、延伸及檢測(cè)熒光，45個(gè)循環(huán)。結(jié)果判斷：FAM、VIC通道分別對(duì)應(yīng)SARS-CoV-2的ORFlab基因和N基因；陽性：2個(gè)通道同時(shí)滿足待測(cè)樣本循環(huán)閾值(Ct)≤35，擴(kuò)增曲線呈S型；陰性：2個(gè)通道結(jié)果Ct>38或未檢出；可疑：有一個(gè)通道結(jié)果Ct≤35，其他一個(gè)通道35

1.5化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)病毒IgM/IgG 定點(diǎn)醫(yī)院將4名患者血清送本院檢測(cè)SARS-CoV-2抗體。用i Flash 3000-H化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套新型冠狀病毒IgM和IgG抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。結(jié)果<10 AU/mL為陰性，≥10 AU/mL為陽性。

2 結(jié)果

2.1不同類型標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果 4名患者中咽拭子全部為陽性，2名鼻拭子陽性，3名糞便標(biāo)本陽性，尿液標(biāo)本均未檢出病毒，1名血清標(biāo)本可疑，見表1。

表1 患者不同部位采集標(biāo)本的核酸Ct值

2.2血清SARS-CoV-2抗體檢測(cè)結(jié)果 患者3在2月4日檢測(cè)結(jié)果為IgM 14.36 AU/mL，IgG 82.29 AU/mL，2月7日檢測(cè)結(jié)果為IgM 61.96 AU/mL，IgG 152.67 AU/mL。其余患者一周內(nèi)IgM和IgG檢測(cè)均為陰性。

3 討論

本文通過4名COVID-19確診患者的咽拭子、鼻拭子、糞便、尿液、分離血清中的核酸以及血清抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：患者的咽拭子檢出率最高，其次是糞便、鼻拭子，1名患者血清核酸結(jié)果可疑，尿液標(biāo)本均未檢出病毒核酸。本研究中咽拭子檢出率最高，糞便標(biāo)本中病毒同樣也有較高的陽性率，說明患者在感染早期腸道內(nèi)也易攜帶病毒[3]；其他樣本類型陽性率不高。可能由于患者處于病程早期，病情較輕，病毒潛伏期長(zhǎng)且病毒載量低，核酸檢測(cè)試劑盒的靈敏度對(duì)于低載量病毒的檢出率低；不同部位存在的病毒載量有所不同，導(dǎo)致不同部位的標(biāo)本病毒檢出率不同[4]。

在本研究中，患者1糞便標(biāo)本中病毒載量高于鼻咽拭子，可能該患者的腸道病毒受體多于呼吸道受體，與個(gè)體差異有關(guān)?；颊?的鼻、咽拭子、糞便核酸檢測(cè)結(jié)果均為陽性，分離血清標(biāo)本也可以檢出低載量的病毒，可能與患者男2的病情相對(duì)較重，病毒載量高有關(guān)，有文獻(xiàn)指出血液和肛拭子中病毒的檢出與重癥出現(xiàn)呈正相關(guān)，應(yīng)注意監(jiān)測(cè)患者病情，警惕患者病情加重[5]?；颊?在2月1日咽拭子核酸檢測(cè)陽性，尿液標(biāo)本和糞便標(biāo)本均陰性，2月4日化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)患者血清IgM、IgG陽性，2月7日IgM、IgG進(jìn)一步升高，說明患者血清中開始出現(xiàn)抗體，抗體的動(dòng)態(tài)檢測(cè)可以確定患者是否感染及觀察治療效果，可運(yùn)用于流行病學(xué)調(diào)查。由于以上患者確診后轉(zhuǎn)入定點(diǎn)傳染病醫(yī)院進(jìn)行治療，我們無法獲得更多的血清學(xué)抗體動(dòng)態(tài)數(shù)據(jù)?？傊琒ARS-CoV-2檢測(cè)時(shí)可以采取多種類型標(biāo)本聯(lián)合檢測(cè)，提高病毒的檢出率，對(duì)于有臨床癥狀但核酸陰性的患者可以采用血清學(xué)抗體檢測(cè)作為補(bǔ)充，共同提高病毒檢測(cè)的陽性率，為病情的確診和疫情的控制提供支持。