劉茹鳳，石繼春，王春娥，李康，李江姣，徐瀟，徐穎華，辛曉芳，葉強(中國食品藥品檢定研究院細菌多糖和結合疫苗室(醫(yī)學細菌保藏研究中心)，衛(wèi)生部生物技術產業(yè)鑒定方法及其標準化重點實驗室，北京 102629)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,KP)可引起敗血癥、肺炎、泌尿系統(tǒng)感染、手術部位感染和導管相關性感染等院內感染[1-2]，也可造成化膿性肝膿腫等社區(qū)獲得性感染[3]。莢膜是KP主要的毒力因子之一，目前鑒定有80多個莢膜血清型，其中K1、K2、K5、K20、K54、K57型與人類各種侵襲性感染密切相關，稱為高毒力莢膜血清型KP[4-5]。中國醫(yī)學細菌保藏管理中心(National Center for Medical Culture Collections，CMCC)收集保藏的KP主要用作生物安全評估的參考菌種和KP國家參考品的制備，參考品用于KP相關診斷試劑的質量控制，因此參考品菌株及候選菌株的質量控制尤為重要。本研究對CMCC收集保藏的KP進行了鑒定驗證和分子生物學的初步分析。

1 材料和方法

1.1菌株來源 20株KP均由CMCC提供，菌株編號分別為CMCC(B)46102、46103、46104、46105、46107、46108、46109、46110、46111、46113、46114、46115、46116、46117、46118、46120、46121、46122、46123和46124。

1.2主要儀器與試劑 Vitek 2 Compact 全自動微生物分析系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司)，飛行質譜儀microTyper MS及配套試劑甲酸、乙腈、基質α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，HCCA)(江蘇天瑞公司)，培養(yǎng)箱(上海印溪公司)，T100基因擴增儀、水平電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，高速冷凍離心機(Eppendorf公司)；普通瓊脂培養(yǎng)基和普通營養(yǎng)肉湯(美國BD公司)，DNeasy Blood & Tissue Kit(德國QIAGEN公司)，Premix Taq試劑、DNA marker DL2000、DL1000(大連寶生物公司)，瓊脂糖(美國Promega公司)，引物由上海英濰捷基公司合成。

1.3拉絲試驗 用接種環(huán)挑起瓊脂平板上過夜培養(yǎng)新鮮菌落，重復2次，若2次均有黏液絲形成并且長度大于5 mm，則判為拉絲試驗陽性，即該菌株為高黏液(hypermucoviscosity，HMV)表型KP[6]。

1.4DNA提取 將KP接種至普通瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)18 h，收集菌體，參照DNeasy Blood & Tissue Kit說明書提取基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.516S rRNA基因分析 以提取基因組DNA為模板，應用通用引物[7](引物序列見表1)進行擴增。PCR反應體系為50 μL，包括Premix Taq 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA 模板5 μL，ddH2O 18 μL。PCR 反應條件：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增產物經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果并拍照。將陽性擴增產物(約為1 400 bp)送上海生工生物公司進行純化和Sanger法測序，用ABI 3730XL測序儀及配套試劑進行(測序前電泳質控，根據圖譜條帶質量安排測序)。測序結果序列在NCBI中比對，并應用MegAlign軟件將測序結果與已發(fā)表的相同種屬的模式菌株進行同源性及進化樹分析。

表1 本文所用引物序列

1.6莢膜血清型基因檢測 采用PCR方法檢測KP莢膜血清型基因(K1、K2、K5、K20、K54 和K57)[8-9]，引物序列見表1。PCR反應體系為50 μL，包括Premix Taq 25 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，DNA模板5 μL，ddH2O 18 μL。莢膜血清型基因PCR反應條件：95 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 90 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴增產物經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察并拍照、測序及分析同1.5部分。

1.7多位點序列分型(MLST) 參照Institute Pasteur(https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/)及相關文獻[10]合成引物，以提取的基因組總DNA為模板，對KPgapA、infB、rpoB、phoE、mdh、pgi、tonB7個管家基因進行擴增。PCR反應條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。選取目的條帶切膠回收后進行測序，將測序結果進行拼接，然后在Institute Pasteur數據庫中進行比對，獲得各管家基因位點的等位基因數值，并形成相應的等位基因譜，判斷其序列型(sequence type,ST)。

1.8質譜鑒定 菌種復蘇并接種普通瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃過夜進行基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)分析：取少量菌涂滿對應靶孔，每株菌2孔，自然干燥后加入1 μL甲酸：乙腈(體積比1∶1)裂解液，自然干燥后，加1 μL HCCA，干燥后進行檢測。然后根據分析的主要因素信噪比(signal/noise，S/N)；篩選特異質量峰，方法：S/N≤1.7，鑒定不合格，儀器顯示紅色；1.7

2 結果

2.1高黏液表型檢測及血清莢膜分型分布 20株CMCC保存KP檢出黏液絲試驗陽性6株，分別為CMCC 46108、46109、46115、46116、46118和46124。檢出K2型3株(CMCC 46108、46109、46117)、K5型4株(CMCC 46110、46111、46115、46121)、K54型1株(CMCC 46111)、K57型4株(CMCC 46108、46109、46117、46124)，未檢出K1型和K20。在黏液絲陽性菌株中，高毒力莢膜血清型KP檢出率為100%；在黏液絲陰性菌株中，高毒力莢膜血清型KP檢出率為24.6%(4/14)。

2.216S rRNA 基因分析 20株菌株均擴增出約1 400 bp大小16S rRNA片段，將拼接序列在https://www.ezbiocloud.net中進行比對，與KP模式菌株(DSM 30104)的相似性均>99%，進化樹見圖1。

2.3質譜鑒定 20株菌株均為KP，且得分均大于2。其中有4株鑒定到亞種，包括肺炎亞種3株(CMCC 46114、46116、46120)和鼻硬結亞種1株(CMCC 46111)。

2.4MLST分型 20株KP分為ST3型4株(CMCC 46105、46113、46114、46120)、ST91型3株(CMCC 46107、46110、46115)、ST86型3株(CMCC 46108、46109、46117)、ST2791型2株(CMCC 46103和46104)、ST67型2株(CMCC 46111、46116)、ST11型2株(CMCC 46118、46122)、ST478型1株(CMCC 46102)、ST15型1株(CMCC 46123)、ST660型1株(CMCC 46124)、ST4073型1株(CMCC 46121)。

3 討論

CMCC收集保藏的菌種是曾經的流行菌株和模式菌株，本文用PCR方法實現保藏KP菌株莢膜血清分型[11]，用MLST分型獲得菌株流行特征[10]，并用質譜技術確定菌種，以評價國家標準菌株質量，并增補之前表型質量指標。20株典藏KP中檢出常見的強毒性莢膜型K2、K5、K54和K57型共有12株，包括K2型3株，K5型4株，K54型1株和K57型4株。MLST分型技術將20株菌種分為10個不同ST型，顯示KP菌株多樣性豐富。質譜技術將其中4株KP鑒定到亞種。

本研究本著對保藏的KP菌株質量控制為出發(fā)點，為以后納入新菌株提供質控指標。從莢膜分型來看，中心收藏的菌株比較全面，可以為研究機構等單位提供高質量、系統(tǒng)、全面的參考菌株。CMCC收藏全球各地菌株，大部分為具有代表性流行株，可為KP研究的進一步發(fā)展提供對照。

在KP研究迅速發(fā)展的情形下，多角度多方位進行菌種分析鑒定很有必要。本研究在菌種驗證方面，補充了菌株的黏液表型、16S rRNA基因、質譜鑒定、MLST分型信息和6種常見高毒力莢膜血清型的鑒定，為KP參考候選菌株的選擇提供參考，有利于更好地對相關診斷試劑產品進行質量控制。