李雪潔，崔大偉，滕曉東(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院.病理科,.輸血科，杭州310003)

胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，5年生存率僅為2%[1]。雖然切除術(shù)后PDAC患者具有較高的生存率，但多數(shù)患者就診時(shí)已是晚期，僅有15%～20%的PDAC患者在發(fā)生早期病變時(shí)有手術(shù)機(jī)會(huì)[2]。糖類(lèi)抗原19-9(CA19-9)作為臨床上常用的PDAC診斷腫瘤標(biāo)志物，其敏感性和特異性均不甚理想[3]。因此，迫切需要尋找更好的腫瘤標(biāo)志物或多項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，以提高早期PDAC的檢出率。目前已報(bào)道的PDAC篩查腫瘤標(biāo)志物種類(lèi)繁多，非常有必要對(duì)候選腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行系統(tǒng)性評(píng)估[4]。本研究擬通過(guò)篩選癌癥基因圖譜計(jì)劃(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)，并對(duì)初步篩選的候選腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行ELISA法檢測(cè)，以期構(gòu)建早期PDAC篩查的腫瘤標(biāo)志物模型。

1 材料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2018年10月至2019年12月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科就診的PDAC患者100例，男65例，女35例，年齡38～79歲，中位年齡55歲。均按照PDAC診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)手術(shù)切除標(biāo)本或B超引導(dǎo)下細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)標(biāo)本經(jīng)病理組織學(xué)檢查明確診斷；(2)B超、CT、MRI、逆行胰膽管造影(ERCP)、超聲內(nèi)鏡(EUS)、經(jīng)皮肝穿刺膽管造影(PTC)等證實(shí)胰腺有占位性病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)已接受放、化療的患者；(2)同時(shí)患有嚴(yán)重的肝腎功能不全、糖尿病、感染、其他類(lèi)型腫瘤；(3)非PDAC初診患者。按照美國(guó)國(guó)立綜合癌癥臨床實(shí)踐指南[6]進(jìn)行臨床分期，分為早期PDAC 75例，中晚期PDAC 25例。相關(guān)疾病對(duì)照組收集同期就診的30例慢性胰腺炎患者(按照慢性胰腺炎確診標(biāo)準(zhǔn)[7]確診)，男12例，女18例，年齡36～69歲，中位年齡52歲；以及30例胰腺良性囊腫患者(經(jīng)病理組織學(xué)明確診斷為胰腺囊腺瘤)，男17例，女13例，年齡42～68歲，中位年齡55歲。另收集同期本院體檢中心體檢健康者40例作為健康人對(duì)照組，男17例，女23例，年齡28～55歲，中位年齡48歲。本研究通過(guò)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(No.ZYYY-D-2019940)，所有研究對(duì)象均知情同意。

1.2標(biāo)本采集 采集各研究對(duì)象治療前的空腹靜脈血(體檢健康者于體檢時(shí)采集)3 mL，EDTA-K2抗凝,2 000 r/min離心5 min，收集血清，于2 h內(nèi)完成檢測(cè)。

1.3主要試劑與儀器 CA19-9、白細(xì)胞激活粘附因子(ALCAM)、殼多糖酶3樣蛋白(CHI3L1)、醛脫氫酶8A1融合蛋白(COL18A1)、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白(IGFBP2)、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2(LCN2)、亮氨酸糖蛋白1(LRG1)、溶菌酶(LYZ)、尼曼病蛋白2(NPC2)、帕金森氏病蛋白7(PARK7)、再生胰島衍生蛋白3(REG3A)、分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制因子(SLPI)、組織蛋白酶S(CTSS)、血小板凝血酶蛋白1(THBS1)、組織金屬蛋白酶抑制因子(TIMP1)、腫瘤壞死因子受體超家族成員1A(TNFRSF1A)和四二硫化物核心域蛋白2(WFDC2)ELISA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Abcam公司)；Thermo Scientific Multiskan GO酶聯(lián)儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)。

1.4數(shù)據(jù)庫(kù)篩選腫瘤標(biāo)志物 收集TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中所有可獲取的近5年P(guān)DAC研究數(shù)據(jù)(2014年12月至2019年12月)。步驟：(1)登錄TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)優(yōu)化后的GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(www.gepia2.cancer-pku.cn)，選擇癌腫類(lèi)型為PAAD(胰腺導(dǎo)管腺癌在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的樣本代號(hào))進(jìn)行檢索，網(wǎng)站輸出突變的mRNA共計(jì)85個(gè)；(2)文獻(xiàn)檢索：在PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)檢索對(duì)應(yīng)時(shí)間(2014年12月至2019年12月)發(fā)表的PDAC研究，檢索上述85個(gè)mRNA，并分析每個(gè)mRNA在PDAC和健康人組織中表達(dá)水平的高低(以表達(dá)量中位數(shù)為分界點(diǎn))，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，共篩選出17個(gè)目標(biāo)基因，分別為：CA19-9、ALCAM、CHI3L1、COL18A1、IGFBP2、LCN2、LRG1、LYZ、NPC2、PARK7、REG3A、SLPI、CTSS、THBS1、TIMP1、TNFRSF1A和WFDC2。

1.5ELISA法檢測(cè)各腫瘤標(biāo)志物 取各研究對(duì)象血清標(biāo)本100 μL，按照上述17種腫瘤標(biāo)志物ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)，Thermo Scientific Multiskan GO酶聯(lián)儀檢測(cè)吸光度(A450 nm)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)線性回歸方程，計(jì)算各指標(biāo)的濃度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。各腫瘤標(biāo)志物參考范圍(ng/mL)分別為：CA19-9<5.2，ALCAM<3.4，CHI3L1<2.9，COL18A1<1.9，IGFBP2<4.8，LCN2<5.7，LRG1<2.3，LYZ<1.7，NPC2<2.3，PARK7<4.2，REG3A<3.1，SLPI<3.6， CTSS<2.4，THBS1<2.3，TIMP1<2.8，TNFRSF1A<2.9和WFDC2<4.1。

2 結(jié)果

2.1各組17種候選腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)水平 ELISA法檢測(cè)結(jié)果表明，17種候選腫瘤標(biāo)志物中有7種蛋白質(zhì)(分別為IGFBP2、LRG1、CA19-9、REG3A、COL18A1、TIMP1和TNFRSF1A)在PDAC組中的表達(dá)水平顯著高于相關(guān)疾病對(duì)照組及健康人對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 17種候選腫瘤標(biāo)志物在各組中表達(dá)水平(ng/mL)的比較

2.27種腫瘤標(biāo)志物在早期、中晚期PDAC患者血清標(biāo)本中的比較結(jié)果 進(jìn)一步分析表1中呈差異表達(dá)的7種腫瘤標(biāo)志物在早期、中晚期PDAC患者血清標(biāo)本中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CA19-9、 TIMP1、LRG1在兩組中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 7種腫瘤標(biāo)志物在早期、中晚期PDAC患者血清中的表達(dá)(ng/mL)

2.3CA19-9、 TIMP1、LRG1單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)早期PDAC的診斷效能 以早期PDAC患者作為疾病組，非PDAC患者 (健康人對(duì)照組、良性囊腫患者、慢性胰腺炎患者)作為對(duì)照組，經(jīng)二元Logistic回歸分析，3種腫瘤標(biāo)志物與診斷早期PDAC的相關(guān)程度見(jiàn)表3。建立的Logistic回歸模型為：ln[P/(1-P)]= 0.412× TIMP1+0.054×LRG1+25.6×CA19-9-14.4，計(jì)算出每個(gè)樣本的P值，得到預(yù)測(cè)概率。繪制ROC曲線，該預(yù)測(cè)概率的ROC曲線下面積(AUCROC)為0.950，結(jié)果見(jiàn)圖1和表4。分別以CA19-9>38.2 ng/mL、TIMP1>21.9 ng/mL、LRG1>16.9 ng/mL、三者聯(lián)合的預(yù)測(cè)概率>60%作為cut-off值，3種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)診斷早期PDAC的敏感性、特異性及準(zhǔn)確性均高于單獨(dú)檢測(cè)和兩兩聯(lián)合檢測(cè)。見(jiàn)表4。

表3 3種腫瘤標(biāo)志物的Logistic回歸分析結(jié)果

表4 CA19-9、TIMP1和LRG1單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)早期PDAC的診斷效能比較

3 討論

本研究首先從數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索并初步篩選出17個(gè)目標(biāo)基因(CA19-9、ALCAM、CHI3L1、COL18A1、IGFBP2、LCN2、LRG1、LYZ、NPC2、PARK7、REG3A、SLPI、CTSS、THBS1、TIMP1、TNFRSF1A和WFDC2)，與Kim等[8]的研究結(jié)果相比少了3個(gè)(分別為MMP2、MMP10和THBS2)，較Song等[9]的研究結(jié)果相比少了6個(gè)(OPG、OPN、ICAM-1、SAA、ApoA1、CEA和CRP)?？赡苁怯捎谙薅l件不完全相同，導(dǎo)致初步目標(biāo)基因數(shù)量略有差異，但本研究與上述文獻(xiàn)均重疊了這17個(gè)目標(biāo)基因，由此可見(jiàn)這些基因可能作為篩選早期PDAC的潛在腫瘤標(biāo)志物。

本研究采用ELISA法進(jìn)一步驗(yàn)證在PDAC患者血清標(biāo)本中存在明顯差異的7種腫瘤標(biāo)志物(IGFBP2、LRG1、CA19-9、REG3A、COL18A1、TIMP1和TNFRSF1A)，這7種腫瘤標(biāo)志物在健康人群或相關(guān)疾病對(duì)照者血清中含量較低，能較好地用于疾病的區(qū)分。Root等[10]檢測(cè)了30例PDAC患者、20例健康人和10例慢性胰腺炎患者血清標(biāo)本中7種與本研究相同的候選生物學(xué)標(biāo)志物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這7種蛋白質(zhì)的表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其與本研究結(jié)果僅存在表達(dá)水平的差異，可能是地域和人群選擇，亦或是樣本類(lèi)型(血清)、儲(chǔ)存和測(cè)定條件(試劑和ELISA選擇)等造成的結(jié)果差異。

本研究應(yīng)用Logistic回歸模型并結(jié)合ROC曲線分析在早期與中晚期PDAC患者血清中表達(dá)差異的3種腫瘤標(biāo)志物(CA19-9、TIMP1、LRG1)，并進(jìn)一步分析其在早期PDAC診斷中的臨床意義，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該3種標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)診斷早期PDAC患者的AUCROC、敏感性、特異性和準(zhǔn)確性均高于任一腫瘤標(biāo)志物單項(xiàng)檢測(cè)及兩兩聯(lián)合檢測(cè)，提示該3種標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)可有效提高早期PDAC檢出率。本研究的不足之處是納入的早期PDAC患者例數(shù)偏少，且缺少癌前病變患者，后續(xù)研究中應(yīng)繼續(xù)增加相應(yīng)的標(biāo)本量。此外，仍需要進(jìn)一步對(duì)腫瘤標(biāo)志物組合進(jìn)行嚴(yán)格驗(yàn)證，并除去循環(huán)蛋白質(zhì)之外的其他類(lèi)型腫瘤標(biāo)志物的干擾，以進(jìn)一步提高早期PDAC的診斷效能。