曾俊祥，呂婕，羅婷，余悠悠，潘秀軍(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200092)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的疾病管理一直是臨床診療關(guān)注的熱點(diǎn)問題。消化道內(nèi)窺鏡檢查雖然是IBD診斷及病情監(jiān)測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但也有著成本較高、準(zhǔn)備工作繁瑣、檢查流程有創(chuàng)且易造成患者的不適與痛苦等缺點(diǎn)。實(shí)現(xiàn)相對(duì)無創(chuàng)的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的快速檢測(cè)，能為IBD臨床決策提供更為便捷和快速的支持。近年來歐洲克羅恩病以及結(jié)腸炎組織(european Crohn′s and Colitis Organization,ECCO)、世界胃腸病組織(World Gastroenterology Organization,WGO)以及亞太胃腸病學(xué)會(huì)(Asian Pacific Association of Gastroenterology，APAGE)的共識(shí)指南[1-4]紛紛提出，糞便鈣衛(wèi)蛋白(fecal calprotectin, FC)是一種較為理想的標(biāo)志物，可以在IBD的疾病管理中扮演重要角色，至此FC的臨床應(yīng)用受到重視[5-6]。

FC的準(zhǔn)確檢測(cè)是臨床決策正確的前提條件，但由于檢測(cè)樣本為糞便，其特殊性造成FC檢測(cè)分析前、分析中存在較多難以控制的實(shí)驗(yàn)影響因素[7]，目前尚未得到國內(nèi)學(xué)者及臨床醫(yī)師的足夠重視，但這些因素卻是檢測(cè)結(jié)果主要的潛在誤差來源。因此，本研究擬通過分析在FC檢測(cè)分析前及分析中對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響的因素，以期控制并減少實(shí)驗(yàn)誤差，實(shí)現(xiàn)FC的精確測(cè)定。

1 材料和方法

1.1研究對(duì)象 (1)IBD組：選取2019年1月至2019年6月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科及肛腸外科IBD確診患者30例，其中克羅恩病21例、潰瘍性結(jié)腸炎9例，男17例、女13例，年齡18～63歲，診斷均符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(2018年，北京)》[8]，所有病例臨床資料完整、彼此間無血緣關(guān)系；(2)其他腸炎組：為同期在我院就診以“腹痛、腹瀉”為主訴、經(jīng)消化道內(nèi)窺鏡排除IBD的患者30例，其中男18例、女12例，年齡27～68歲，包括急性感染性腸炎、腸結(jié)核等；(3)健康人對(duì)照組：選取同期于我院體檢的表觀健康者30名作為正常對(duì)照組，其中男14名、女16名，年齡18～53歲，入選標(biāo)準(zhǔn)：無反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹脹、腹瀉等消化道癥狀；既往無消化道出血、腫瘤、潰瘍等病史；糞便成形，糞便常規(guī)結(jié)果正常且隱血試驗(yàn)陰性。3組之間性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(No.XHEC-D-2018076)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2試劑與儀器 試劑A：糞便鈣衛(wèi)蛋白檢測(cè)試劑盒(ELISA法，瑞士BüHLMANN公司)，試劑B：糞便鈣衛(wèi)蛋白檢測(cè)試劑盒(熒光免疫層析法，廈門為正公司)，試劑C：糞便鈣衛(wèi)蛋白檢測(cè)試劑盒(膠體金法，寧波美康公司)；Multiskan Ascent酶聯(lián)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，連續(xù)式免疫分析儀WIZ-A202(廈門為正公司)。

1.3糞便采樣及萃取 向IBD組患者分發(fā)3個(gè)依次標(biāo)記“早”、“中”、“晚”的清潔容器，囑受試者按排便時(shí)間采集24 h內(nèi)糞便(1～3個(gè)樣本)，并按時(shí)間區(qū)間進(jìn)行留樣(早晨：4：00—12：00；中午：12：00—20：00；晚上：20：00—次日4：00)。其他腸炎組和健康人對(duì)照組則囑其收集當(dāng)日第1次排便的糞便樣本。在接收所有受試者樣本1 h內(nèi)按照試劑盒配套萃取管說明書進(jìn)行等質(zhì)量樣本萃取。

1.4方法

1.4.1FC檢測(cè)與結(jié)果判讀 分別用ELISA法、熒光免疫層析法、膠體金法進(jìn)行FC測(cè)定，按照試劑說明書進(jìn)行操作。ELISA法和熒光免疫層析法檢測(cè)分別在Multiskan Ascent酶聯(lián)儀、連續(xù)式免疫分析儀WIZ-A202上讀取結(jié)果，并同時(shí)根據(jù)試劑盒說明書推薦的cut-off值將結(jié)果判定為陽/陰性；膠體金法通過人工肉眼觀察，對(duì)于包含抗原的條帶位置出現(xiàn)著色均勻和清晰可見的顏色反應(yīng)時(shí)，結(jié)果判讀為陽性。

1.4.3留樣時(shí)間對(duì)FC結(jié)果的影響 所有IBD組患者按1.3中方法采集24 h內(nèi)糞便，ELISA法測(cè)定不同時(shí)間區(qū)間樣本的FC濃度，計(jì)算同一患者不同時(shí)間段的糞便樣本的FC結(jié)果變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)。

1.4.4不同方法學(xué)對(duì)FC檢測(cè)結(jié)果的影響 所有研究對(duì)象標(biāo)本分別采用3種不同檢測(cè)方法學(xué)試劑盒配套萃取管按照說明書進(jìn)行萃取，萃取完畢后按照其各自對(duì)應(yīng)檢測(cè)方法進(jìn)行FC測(cè)定。3種檢測(cè)試劑盒相關(guān)性能參數(shù)見表1。

表1 3種檢測(cè)試劑盒相關(guān)性能參數(shù)

2 結(jié)果

2.1FC分析前穩(wěn)定性 隨機(jī)選取3組研究對(duì)象各6例樣本分別置于不同貯存溫度并在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)FC濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7 d內(nèi)不管在25 ℃還是4 ℃保存條件下，3組樣本FC檢測(cè)濃度較初始檢測(cè)濃度均未出現(xiàn)明顯變化(P>0.05)，但在14 d、25 ℃下3個(gè)水平的 FC值較初始檢測(cè)濃度均出現(xiàn)明顯下降(P<0.05)，而在4 ℃保存14 d FC濃度未見變化，由此可判定FC可以在室溫下穩(wěn)定7 d，4 ℃可穩(wěn)定至少14 d。25 ℃下14 d后FC平均降解率為42.1%。見表2、圖1。

表2 不同保存條件下FC檢測(cè)結(jié)果(μg/g)

2.2分析前留樣時(shí)間對(duì)FC結(jié)果的影響 30例IBD組患者共收集61份糞便樣本(12個(gè)患者留樣3份，7個(gè)患者留樣2份，11個(gè)患者留樣1份)。留樣3份的患者24 h內(nèi)FC結(jié)果變化見圖2，早晨樣本FC濃度為541.54(350.82，1 574.25)μg/g，中午樣本為394.65(244.78，629.55)μg/g，晚上樣本為426.75(156.78，785.85)μg/g。同一患者日間FC檢測(cè)結(jié)果差異較大(CV：5.1%～80.2%)，平均CV值為39.6%。

2.3分析中FC不同方法學(xué)測(cè)定結(jié)果一致性分析 試劑盒A、B為定量檢測(cè)，試劑盒C為定性檢測(cè)。對(duì)于定性結(jié)果，根據(jù)Kappa系數(shù)，3種方法學(xué)一致性尚可，見表3。對(duì)于定量檢測(cè)結(jié)果，Bland-Altman分析顯示(圖3A)，ELISA與熒光免疫層析法平均差值398.7 μg/g，B為558.79%，大于可接受范圍(22.6%)[10]；而Passing-Bablok回歸分析顯示(圖3B)，ELISA與熒光免疫層析法相關(guān)方程為Y=0.134 565X+5.730 871，提示2種方法的相關(guān)性差，量值結(jié)果不具備可比性。

3 討論

FC在糞便離體后易被胰蛋白酶降解，Acevedo等[11]對(duì)18位活動(dòng)期UC患者在2 d內(nèi)留取的287例糞便樣本進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過室溫放置7 d，標(biāo)本中的FC水平下降28%。但不同研究報(bào)道的FC在室溫下的穩(wěn)定時(shí)間尚未有一致結(jié)論，最短1 d，最長(zhǎng)7 d。分析原因可能在于：在相同的時(shí)間內(nèi)，高值標(biāo)本的降解率要明顯高于低值標(biāo)本，若研究樣本中高值標(biāo)本占比過大，則研究結(jié)論中穩(wěn)定時(shí)間會(huì)明顯偏短，反之亦然。基于此，本研究特選取IBD患者標(biāo)本作為潛在的高值樣本分析，而其他腸炎組和健康人對(duì)照組作為潛在的中等值和低值樣本，因此可以較好地規(guī)避該因素的影響。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)C可以在室溫下穩(wěn)定7 d，而在4 ℃保存條件可以穩(wěn)定14 d及以上，25 ℃下FC平均降解率為42.1%。因此建議新鮮標(biāo)本要盡快送檢，但對(duì)于一些門診隨訪在自家留樣的患者而言，若樣本不能及時(shí)送檢，需盡量冰袋保存。

有研究報(bào)道，F(xiàn)C具有較大生物變異性，同一患者同一天不同時(shí)間段所排出的糞便的FC含量之間也有較大差異[7]，排便的次數(shù)與排便間隔的長(zhǎng)短也會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。本研究結(jié)果也支持這一結(jié)論，同一患者同一天內(nèi)FC檢測(cè)結(jié)果差異較大(CV：5.1%～80.2%)，平均CV值為39.6%，與Calafat等[12]研究的結(jié)果(52%)接近，清晨樣本FC濃度最高，中午樣本FC濃度最低。由于指南中推薦將FC濃度變化差(△FC)作為療效監(jiān)測(cè)指標(biāo)，連續(xù)監(jiān)測(cè)FC濃度變化對(duì)IBD療效評(píng)估和疾病管理有重要意義，因此為保證結(jié)果具有可比性，我們推薦將清晨第一次排便的標(biāo)本作為檢測(cè)樣本。

由于目前鈣衛(wèi)蛋白沒有參考的檢測(cè)方法和合適的參考物，不同檢測(cè)方法的反應(yīng)原理各不相同，不同的檢測(cè)方法中所用的抗體的來源也不同，且這些抗體所針對(duì)的識(shí)別位點(diǎn)也有所差別，直接造成了檢出限、靈敏度等差異[12-13]。根據(jù)英國國家外部質(zhì)量評(píng)估服務(wù)(the United Kingdom National External Quality Assessment Service)的數(shù)據(jù)表明，不同檢測(cè)方法檢測(cè)同一樣本的FC所得到的定量值結(jié)果間的差異最大能達(dá)到3.8倍[14]。本研究納入3種不同檢測(cè)方法的試劑盒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于定性結(jié)果(陰/陽性)3種檢測(cè)方法一致性尚可接受。但對(duì)于定量結(jié)果，不同檢測(cè)方法的一致性差，量值結(jié)果不具備可比性。因此，對(duì)于臨床上IBD患者的初篩鑒別，不同檢測(cè)方法不會(huì)對(duì)臨床決策產(chǎn)生決定性影響，但對(duì)于IBD患者長(zhǎng)期隨訪與病情監(jiān)測(cè)，F(xiàn)C結(jié)果則需要考慮方法學(xué)一致性。

綜上，作為分析前誤差來源，糞便樣本的送檢時(shí)間和樣本留取時(shí)間可以通過規(guī)范化的手段進(jìn)行有效控制，而不同方法學(xué)FC檢測(cè)盡管定性結(jié)果一致性良好，但是其定量數(shù)值卻差異較大，無法做到結(jié)果互認(rèn)。因此，有必要對(duì)FC的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化與規(guī)范化[15]，使FC的檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，才更具有臨床參考價(jià)值。