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新型冠狀病毒核酸和抗體聯(lián)合檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值*

2020-08-04 01:51陳偉吳成就彭麗梁劍琦朱愛(ài)民黃小曄婁底市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科湖南婁底417000
臨床檢驗(yàn)雜志 2020年6期
關(guān)鍵詞:核酸檢出率標(biāo)本

陳偉,吳成就,彭麗,梁劍琦,朱愛(ài)民,黃小曄(婁底市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖南婁底 417000)

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的傳染性極強(qiáng)的急性傳染病,早發(fā)現(xiàn)傳染源并進(jìn)行隔離治療,是防治COVID-19的重要手段。新型冠狀病毒肺炎診療方案一直以來(lái)均推薦實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性作為疑似病例確診的診斷條件之一,但實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所及人員要求高、操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)人員感染風(fēng)險(xiǎn)高、結(jié)果受標(biāo)本質(zhì)量、病毒感染部位及表達(dá)量等因素影響較大[1]。血清特異性抗體檢測(cè)的操作簡(jiǎn)單便捷,僅需采集血液標(biāo)本,很大程度上降低醫(yī)護(hù)人員在標(biāo)本采集和檢測(cè)過(guò)程中被感染的風(fēng)險(xiǎn),是快速篩查和輔助診斷的重要手段[2]?!缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案(試行第七版)》已將血清學(xué)抗體檢測(cè)列入疑似病例確診的診斷條件之一[3]。鑒于2種檢測(cè)方法各自的特點(diǎn),將核酸檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)相結(jié)合可提高檢出率,不同類(lèi)型患者可選擇不同的檢測(cè)方法。

1 資料和方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 收集2020年2月1日至2020年3月15日本院感染科隔離病房入院的26例確診COVID-19患者的咽拭子和血清標(biāo)本。確診標(biāo)準(zhǔn)[3]:(1)有相應(yīng)流行病學(xué)史;(2)有相關(guān)臨床表現(xiàn)(發(fā)熱和/或呼吸道癥狀、具有COVID-19影像學(xué)特征等);(3)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性。其中男性16例,女性10例,年齡(42.0±18.3)歲。分別于確診后第4、7、15、30和45天采集患者血液標(biāo)本及咽拭子(對(duì)已出院患者進(jìn)行回訪并在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)采集血液和咽拭子標(biāo)本)。

1.2儀器與試劑 Vii7-Dx熒光定量 PCR儀(ABI公司);SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒(湖南圣湘公司),SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測(cè)試劑盒(膠體金免疫層析法,康華公司)。

1.3SARS-CoV-2核酸檢測(cè)(實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法) 待測(cè)標(biāo)本56 ℃滅活30 min后,用SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒提取核酸,按照一步法試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系:26 μL反應(yīng)液,4 μL酶,20 μL核酸,共50 μL。反應(yīng)參數(shù):50 ℃ 30 min,95 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,45個(gè)循環(huán)。用Vii7-Dx熒光定量 PCR儀檢測(cè),熒光通道選擇:VIC(內(nèi)標(biāo)基因)、FAM(ORF1ab基因)、ROX(N基因)。結(jié)果判定:FAM或ROX通道檢測(cè)到典型的S型擴(kuò)增曲線,且循環(huán)閾值(Ct)≤40為陽(yáng)性;FAM、ROX通道未檢測(cè)到典型的S型擴(kuò)增曲線,僅VIC通道有擴(kuò)增曲線且Ct≤40為陰性。一步法檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本采用伯杰新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR 法)作進(jìn)一步確認(rèn)。

1.4SARS-CoV-2血清抗體檢測(cè)(膠體金免疫層析法) 用捕獲法檢測(cè)血清樣本中的IgM抗體,雙抗原夾心法檢測(cè)IgG抗體,標(biāo)本3 000 r/min 離心10 min后,離心機(jī)內(nèi)靜置15 min后取出,二級(jí)生物安全柜內(nèi)開(kāi)蓋。取10 μL待檢血清至加樣處,隨即滴加80 μL樣本稀釋液至加樣處,均于15~30 min后觀察結(jié)果。根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)直接進(jìn)行肉眼判讀,當(dāng)檢測(cè)區(qū)及質(zhì)控區(qū)各出現(xiàn)一條紅色反應(yīng)線為陽(yáng)性,僅質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紅色反應(yīng)線為陰性。

2 結(jié)果

2.1核酸檢測(cè)轉(zhuǎn)陰后IgM/IgG抗體檢出率 26例確診患者病毒核酸檢測(cè)轉(zhuǎn)陰時(shí)間為(16.3±11.6)d,最短為6 d,最長(zhǎng)為45 d(觀察截止時(shí)間),轉(zhuǎn)陰當(dāng)日IgM和IgG的檢出率分別65.38%(16/26)和53.85%(14/26),2種抗體檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.719,P>0.05)。

2.2不同時(shí)間點(diǎn)IgM/IgG抗體檢出率 根據(jù)IgM和IgG抗體產(chǎn)生的一般規(guī)律,選擇5個(gè)時(shí)間點(diǎn)作為抗體檢測(cè)時(shí)間(第4、7、15、30、45天),分析病毒感染后不同類(lèi)型抗體產(chǎn)生后達(dá)到檢出限的時(shí)間和發(fā)展趨勢(shì),IgM抗體在確診后15 d檢出率達(dá)到65.38%,而IgG抗體為46.15%。IgM抗體最早可在確診后4 d內(nèi)檢出(19.23%),并在15 d左右達(dá)到峰值后檢出率逐漸下降,IgG抗體在確診后7 d左右可檢出(檢出率為7.69%),并隨著時(shí)間延長(zhǎng)檢出率持續(xù)上升并維持較長(zhǎng)時(shí)間。見(jiàn)表1和圖1。

表1 26例COVID-19患者不同時(shí)間點(diǎn)血清抗體檢出率(%)

2.3不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)標(biāo)基因、ORF1ab基因、N基因的Ct值 內(nèi)標(biāo)基因在不同患者不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量基本恒定,ORF1ab基因和N基因表達(dá)量在一周內(nèi)出現(xiàn)明顯下降,N基因的下降速率明顯低于ORF1ab基因。到觀察截止時(shí)間點(diǎn)(45 d)仍有1例ORF1ab基因陽(yáng)性(Ct為38.05)和5例N基因陽(yáng)性(Ct為35.47±3.12)。見(jiàn)表2。

表2 不同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)循環(huán)閾值(Ct)結(jié)果

3 討論

鑒于SARS-CoV-2的高傳染性,控制疫情蔓延最有力措施就是對(duì)確診患者的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早隔離、早治療,國(guó)家推薦核酸檢測(cè)為新冠病毒肝炎確診的金標(biāo)準(zhǔn),但同時(shí)核酸檢測(cè)也可因?yàn)椴杉课弧⒎椒?、病程等因素的影響而出現(xiàn)假陰性結(jié)果[4-5]。膠體金免疫層析法具有快速、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn),相比核酸檢測(cè),具有成本較低、對(duì)操作人員技術(shù)要求不高、無(wú)需特殊儀器、試劑穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),適合于大面積推廣。

IgM抗體是機(jī)體在急性期感染時(shí)較早出現(xiàn)的抗體,親和力較低,持續(xù)時(shí)間短。IgG抗體是再次免疫應(yīng)答產(chǎn)生的抗體,親和力較強(qiáng),持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),提示既往感染或是病程中后期。目前,COVID-19患者的體液免疫應(yīng)答機(jī)制尚未完全明確,但其抗體變化規(guī)律與一般病毒感染存在一定的相似性[6-7],SARS-CoV-2特異性IgM多在發(fā)病后3~5 d出現(xiàn)陽(yáng)性。來(lái)自武漢的研究顯示:COVID-19患者IgM和IgG抗體檢測(cè)的敏感性分別為70.24%和96.10%,抗體檢出率較高[8]。本研究根據(jù)病毒感染的特異性IgM抗體和IgG抗體的產(chǎn)生規(guī)律,選擇5個(gè)時(shí)間點(diǎn)作為檢測(cè)時(shí)間(第4、7、15、30、45天),分析病毒感染后不同類(lèi)型抗體產(chǎn)生后達(dá)到檢出限的時(shí)間和發(fā)展趨勢(shì),IgM抗體在確診后15 d檢出率達(dá)到65.38%,而IgG抗體為46.15%,IgM抗體最早可在確診4 d內(nèi)檢出,并在15 d左右達(dá)到峰值后逐漸下降,IgG抗體在7 d左右可檢出,并隨著時(shí)間延長(zhǎng)檢出率持續(xù)上升并維持較長(zhǎng)時(shí)間。

SARS-CoV-2基因組含有約29 000個(gè)堿基,有 12 個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)/開(kāi)放讀碼框(ORF),其中ORF1ab基因?yàn)镽NA依賴(lài)的RNA聚合酶基因(RdRp)所在區(qū)域,編碼RNA聚合酶,負(fù)責(zé)病毒核酸復(fù)制[9];N基因編碼核衣殼蛋白,是一種多功能結(jié)構(gòu)蛋白,具有增強(qiáng)病毒基因組轉(zhuǎn)錄、病毒組裝過(guò)程中與其他蛋白質(zhì)結(jié)合等特征。有研究表明確診病例和無(wú)癥狀感染者第3周這2個(gè)基因的Ct值高于第2周,提示病程的進(jìn)展、相關(guān)診療手段的實(shí)施,病毒載量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而下降[10]。本研究中發(fā)現(xiàn),病毒2個(gè)基因的表達(dá)量隨著病程的進(jìn)展下降程度不一樣。ORF1ab基因表達(dá)量在一周內(nèi)明顯下降,而N基因的下降速率明顯減慢,觀察結(jié)束時(shí)N基因的檢出率高于ORF1ab基因,可能與2種基因編碼的蛋白質(zhì)功能不同有關(guān),治療過(guò)程中與病毒復(fù)制有關(guān)的ORF1ab基因表達(dá)受到明顯的抑制,而對(duì)核衣殼蛋白編碼基因(N基因)影響較小。N基因的持續(xù)表達(dá)對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生持續(xù)的免疫刺激,從而提高抗體的產(chǎn)生效率。

核酸檢測(cè)和血清抗體檢測(cè)各有優(yōu)劣:核酸檢測(cè)成本高、技術(shù)要求高且費(fèi)時(shí),標(biāo)本采樣、病毒滅活、核酸提取等過(guò)程對(duì)核酸檢測(cè)結(jié)果影響較大,容易出現(xiàn)假陰性;而血清抗體檢測(cè)因檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、具有較高的敏感性和特異性。本研究發(fā)現(xiàn)在感染早期(7 d內(nèi))核酸檢測(cè)檢出率較高,IgM抗體開(kāi)始產(chǎn)生并且檢出率持續(xù)升高,而病程中后期IgM和IgG抗體的檢出率明顯高于核酸檢測(cè)。因此,可以將2種方法有效結(jié)合起來(lái),以核酸檢測(cè)為主并輔以抗體檢測(cè),以判斷感染早期、既往感染和無(wú)癥狀感染者。

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