王春霞 岳師師 毛炎佳

[摘要] 目的 探討補腎助孕湯對體外培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細胞生長中Smad3、Smad4的表達作用，為中藥復方的研究提供實驗數(shù)據(jù)支撐。 方法 用生長良好的大鼠顆粒細胞，調(diào)整細胞為1×104 cells/1 mL，用24孔細胞培養(yǎng)板，每孔滴入少許培養(yǎng)基，然后放入直徑24 mm的蓋玻片，讓培養(yǎng)液與玻片粘合在一起，每孔再加入細胞懸液37℃ 5%CO2進行培養(yǎng)，在6 h、12 h、24 h進行觀察培養(yǎng)細胞的貼片情況，用免疫組化SP法染色鏡檢。 結(jié)果 補腎助孕湯各劑量組用藥后Smad3、Smad4的陽性率均高于對照組，Smad3：高劑量組用藥6 h、12 h、24 h分別與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），中劑量組用藥6 h、12 h、24 h分別與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），低劑量組用藥12 h高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），各劑量組用藥12 h最高，其高于用藥6 h、24 h，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;Smad4：高劑量組和中劑量組用藥6 h、12 h、24 h與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），低劑量組用藥12 h高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結(jié)論 補腎助孕湯能夠促進體外培養(yǎng)的卵巢顆粒細胞的增殖分化，通過促進TGF-β1的含量上調(diào)Smad3、Smad4的表達，從而促進卵泡生長發(fā)育。

[關鍵詞] 補腎助孕湯;卵巢顆粒細胞;Smad3;Smad4;信號通路

[中圖分類號] R329 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）15-0040-04

Study of the effect of kidney tonifying and gestation promoting decoction on rat ovarian granulosa cells Smad3 and Smad4

WANG Chunxia1 ? YUE Shishi2 ? MAO Yanjia2 ? JIANG Yaru2 ? LIU Yuchun1 ? YAN Sha1 ? LI Yongwei1

1.He'nan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine， Zhengzhou ?450002， China; 2.He'nan University of Chinese Medicine， Zhengzhou ? 450046， China

[Abstract] Objective To explore the effect of kidney tonifying and gestation promoting decoction on the expression of Smad3 and Smad4 in the growth of rat ovarian granulosa cells through in vitro culture， so as to provide experimental data support for the research of traditional Chinese medicine compound prescription. Methods Rat granulosa cells with good growth were chosen and adjusted to 1×104 cells/1 mL. A little culture medium was dropped into each well of 24-well cell culture plates， and then a cover glass with a diameter of 24 mm was put in to be bonded to the culture solution. Cell suspension 37°C 5% CO2 was added to each well for culture. The patch of cultured cells was observed at 6 h， 12 h， 24 h， and was given immunohistochemical SP staining and microscopic examination. Results The positive rates of Smad3 and Smad4 in each dose group of kidney tonifying and gestation promoting decoction were higher than those in the control group. Smad 3： High-dose group and the control group were compared at 6 h， 12 h， and 24 h of administration， with statistically significant difference（P<0.05）. Medium-dose group and the control group were compared at 6 h， 12 h， and 24 h of administration， with statistically significant difference（P<0.05）. The positive rate in low-dose group at 12 h of administration was higher than that in the control group， with statistically significant difference（P<0.05）. In all dose groups， the positive rate at 12 h of administration was higher than that at 6 h and 24 h， with statistically significant difference（P<0.05）. Smad4： High-dose group and medium-dose group at 6 h， 12 h， and 24 h of administration， were compared with the control group， with statistically significant difference（P<0.05）. The positive rate of low-dose group at 12 h of administration was higher than that of the control group， with statistically significant difference（P<0.05）. Conclusion Kidney tonifying and gestation promoting decoction can promote the proliferation and differentiation of ovarian granulosa cells in vitro， and regulate the expression of Smad3 and Smad4 up by increasing the content of TGF-β1， so as to accelerate the growth and development of follicles.

[Key words] Kidney tonifying and gestation promoting decoction; Rat ovarian granulosa cell; Smad3; Smad4; Signal pathway

卵巢顆粒細胞是卵泡的功能單位，其增殖、分化與卵泡的生長發(fā)育密切相關[1]。而顆粒細胞主要通過本身的分化、信號通路的轉(zhuǎn)導以及分泌的細胞因子發(fā)揮作用。Smads蛋白是TGF-β信號通路唯一的底物蛋白[2]。補腎助孕湯是王春霞教授在長期臨床實踐中的經(jīng)驗方，通過多年臨床觀察對于恢復月經(jīng)周期、促進排卵具有良好的臨床效果，且臨床觀察中未發(fā)現(xiàn)并發(fā)癥及副作用[3]。為了解其對卵泡生長發(fā)育的作用，本文用大鼠卵巢顆粒細胞進行實驗研究，觀察其對Smads蛋白的變化影響并分析作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗細胞

大鼠卵巢顆粒細胞購于武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司，產(chǎn)品編號：RAT-CELL-0077，規(guī)格：5×105 cells/1 mL。

1.2 實驗用藥與耗材

補腎助孕湯（菟絲子，規(guī)格：10 g/袋，批號：1905006C、當歸，規(guī)格：10 g/袋，批號：1906013C、枸杞子，規(guī)格：5 g/袋，批號：1906001C、熟地，規(guī)格：10 g/袋，批號：1905004W、制何首烏，規(guī)格：10 g/袋，批號：1812003C、白芍，規(guī)格：10 g/袋，批號：1906001W、川芎，規(guī)格：6 g/袋，批號：1906003C、黃芪，規(guī)格：10 g/袋，批號：1907001W、炙淫羊藿，規(guī)格：10 g/袋，批號：1901002C、山藥，規(guī)格：10 g/袋，批號：1904006W、牛膝，規(guī)格：5 g/袋，批號：1906001C;三九制藥）。注射用尿促性素針（HMG），麗珠集團麗珠制藥廠，規(guī)格：75 U，批號：180504;細胞培養(yǎng)基：批號：0012519，BI生物公司;牛血清：批號：1924622，BI生物公司;大鼠單抗Smad3/Smad4免疫組化試劑，批號：bs-4539R，武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 實驗分組及檢測

選擇生長良好的大鼠顆粒細胞，用細胞計數(shù)板進行計數(shù)，調(diào)整細胞為1×104 cells/mL，用24孔細胞培養(yǎng)板，每孔滴入少許培養(yǎng)基，然后放入直徑24 mm的蓋玻片，讓培養(yǎng)液與玻片粘合在一起，每孔再加入細胞懸液進行培養(yǎng)分為對照組（空白）、高劑量組（含生藥3.24 g/mL）、中劑量組（含生藥1.62 g/mL）、低劑量組（含生藥0.81 g/mL）、HMG組（陽性對照組），每組6孔37℃ 5%CO2進行培養(yǎng)，進行細胞爬片，在6 h、12 h、24 h進行觀察，用免疫組化SP法染色鏡檢，細胞核被染成紫藍色陽性，觀察陽性細胞百分比進行分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用R3.5.3進行統(tǒng)計描述與推斷。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用重復測量資料方差分析進行統(tǒng)計推斷，分析變量間的交互效應、主效應、單獨效應及多重比較，α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同含量補腎助孕顆粒對大鼠卵巢顆粒細胞Smad3、Smad4的核陽性率比較

補腎助孕湯各劑量組用藥后Smad3、Smad4的陽性率均高于對照組，Smad3：高劑量組用藥6 h、12 h、24 h分別與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），中劑量組用藥6 h、12 h、24 h分別與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），低劑量組用藥12 h高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），各劑量組用藥12 h最高，其高于用藥6 h、24 h，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;Smad4：高劑量組和中劑量組用藥6 h、12 h、24 h與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），低劑量組用藥12 h高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 時間因素、分組因素主效應及其交互效應統(tǒng)計推斷結(jié)果

對于Smad3、Smad4陽性率，時間因素與不同劑量藥物分組因素間存在交互效應，統(tǒng)計推斷結(jié)果具有統(tǒng)計學意義;時間因素主效應與分組因素主效應同樣具有統(tǒng)計學意義。見表2。

2.3 補腎助孕湯劑量分組因素與時間因素的單獨作用及多重比較

2.3.1 分組因素 ?劑量分組因素的單獨效應分析結(jié)果見表1，各時間點固定時各組間差異具有統(tǒng)計學意義;多重比較結(jié)果見圖1，95%置信區(qū)間不包含0.00點時，差異具有統(tǒng)計學意義。

2.3.2 時間因素 ?時間因素的單獨效應分析結(jié)果見表1，各組固定時各時間點Smad3、Smad4陽性率差異具有統(tǒng)計學意義（對照組除外）;多重比較結(jié)果見圖2，95%置信區(qū)間不包含0.00點時，差異具有統(tǒng)計學意義。

3 討論

《內(nèi)徑》腎藏精，主生殖，是對人體生殖功能的高度概括，腎中之精又有先天之精和后天之精之分，先天之精得到后天之精的濡養(yǎng)得以升華，為腎主生殖的根本[4]?！鹅`樞·經(jīng)脈篇》曰“人始生，先成精”。腎中精氣是孕育的物質(zhì)基礎，精氣的充盈與女性卵泡的生成、發(fā)育、成熟密切相關[5]。隨著高科技的發(fā)展，人們生活節(jié)奏的加快，女性承擔的壓力增大，直接影響女性生殖及內(nèi)分泌功能[6]，出現(xiàn)卵巢早衰、多囊卵巢綜合征、閉經(jīng)、異常子宮出血等疾病的增多，從而影響女性卵泡的發(fā)育、成熟及排出的障礙，造成女性不孕癥的增多[7]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)補腎藥物具有類激素樣的作用，起到改善女性內(nèi)分泌的功能，促進卵泡的發(fā)育與排出[8]。

補腎助孕湯多年臨床觀察總結(jié)出來的對排卵障礙性不孕癥治療的有效方劑，具有補腎填精調(diào)經(jīng)助孕之功[9，10]。補腎助孕湯中熟地、菟絲子能夠補腎填精;制何首烏、枸杞子和當歸能夠滋陰補血;白芍能夠養(yǎng)血調(diào)經(jīng);山藥、黃芪能夠益氣補血;川芎能夠行氣活血;牛膝能夠引血下行;配以炙淫羊藿起到陽中求陰。方中活血化瘀藥能改善卵巢微循環(huán)，起到促進卵泡發(fā)育及排卵的作用。方中的補腎藥能夠增強卵巢和垂體的功能，起到調(diào)節(jié)內(nèi)分泌的作用。

顆粒細胞參與了原始卵泡生長發(fā)育的過程，其發(fā)揮作用的主要機制是自身分化、信號通路的轉(zhuǎn)導及分泌因子達到增殖的目的。卵泡在促卵泡生長激素的作用下使顆粒細胞數(shù)增多，卵泡液增加，促進卵泡生長。促卵泡激素能夠促進雌二醇的合成，而雌二醇也可反饋抑制合成促卵泡生長激素。在哺乳動物的研究中證實，在卵巢的卵母細胞到成熟卵細胞的生長過程中，TGF-β超家族成員在多個環(huán)節(jié)中起著調(diào)控作用[11]，而TGF-β1是TGF-β家族中的一個亞型，在哺乳動物卵巢中主要表達與卵母細胞相關，可促進卵泡的生長發(fā)育和卵子的成熟[12]。在前期試驗中也證實了補腎助孕湯可引起TGF-β1及其受體在卵泡發(fā)育的不同階段表達升高。在TGF-β/Smads信號傳導通路中，Smad3屬于Smads屬下游信號傳導分子，發(fā)揮核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的作用。Smad4在TGF-β/Smads通路中起到中樞作用，能夠活化Smad形成的復合物，協(xié)同調(diào)節(jié)TGF-β的基因轉(zhuǎn)錄，從卵泡的發(fā)育開始直至成熟及排卵后，Smad4均可持續(xù)表達[13，14]。

實驗證明，卵母細胞、顆粒細胞體外培養(yǎng)能夠促進卵細胞的發(fā)育成熟[15]。Gilchrist RB等[16]研究也發(fā)現(xiàn)，Ⅰ型及Ⅱ型受體結(jié)合后能夠激活Smad2和Smad3，能促進顆粒細胞增殖。本研究采用空白對照和激素HMG組作為對照進行研究，實驗結(jié)果表明補腎助孕湯各劑量組用藥后Smad3、Smad4的陽性率均高于對照組，與陽性對照組無統(tǒng)計學差異。Smad3：高劑量組和中劑量組用藥6 h、12 h、24 h與空白對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），低劑量組用藥12 h高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），各劑量組用藥12 h最高，明顯高于用藥6 h、24 h，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;Smad4：高劑量組和中劑量組用藥6 h、12 h、24 h與空白對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），低劑量組用藥12 h高于空白對照組，具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），各劑量組用藥12 h最高，其高于用藥6 h、24 h，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。所以，補腎助孕湯在卵泡生長發(fā)育過程中能夠通過TGF-β/Smads信號通路起到促進卵泡生長發(fā)育的作用。

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（收稿日期：2020-03-18）