羅南 葉蔚 俞蕾敏

[摘要] 綠原酸是中藥金銀花當(dāng)中的主要成分，對于炎癥反應(yīng)的抑制可以起到一定的作用和效果。綠原酸對于巨噬細胞模型上具備抗炎活性的作用，本文先就綠原酸在巨噬細胞源性泡沫凋亡當(dāng)中的誘導(dǎo)作用進行分析，總結(jié)當(dāng)前學(xué)者在這方面的研究進展，為之后的后期研究奠定理論基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 綠原酸;TLR4/NF-κB通路;誘導(dǎo)作用;巨噬細胞;源性泡沫細胞

[中圖分類號] R285 ? ? ? ? ?[文獻標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）15-0189-04

Analysis on the progression of macrophage-derived foam cell apoptosis induced by chlorogenic acid inhibition of TLR4/NF-κB pathway

LUO Nan1， 2 ? YE Wei2 ? YU Leimin2

1.Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou ?310053，China; 2.Department of Gastroenterology， Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou ? 310007，China

[Abstract] Chlorogenic acid is the main component of honeysuckle as a traditional Chinese medicine， which can play a certain role in the inhibition of inflammatory reaction. Chlorogenic acid has anti-inflammatory activity in macrophage model. In this paper， the induction of chlorogenic acid in macrophage-derived foam cell apoptosis was firstly analyzed， and the current research progress achieved by various scholars in this field was then summarized so as to lay a theoretical foundation for the later research.

[Key words] Chlorogenic acid; TLR4/NF-κB pathway; Induction; Macrophage; Derived foam cell

我國心血管疾病在近些年來的發(fā)病率呈明顯的增加趨勢。動脈粥樣硬化是心血管疾病發(fā)生的關(guān)鍵誘導(dǎo)因素之一，其形成又與巨噬細胞源性泡沫細胞之間存在著十分密切的相關(guān)性[1]。為了探討巨噬細胞源性泡沫細胞在動脈粥樣硬化過程中所起到的作用以及綠原酸所起到的抑制作用開展了本次分析。在研究中主要介紹了綠原酸基本內(nèi)容、巨噬細胞源性泡沫等，分析綠原酸的作用以及該物質(zhì)對于巨噬細胞源性細胞凋亡的作用和進展。本文現(xiàn)結(jié)合已有學(xué)者開展研究所得到的結(jié)果為依據(jù)進行詳細論述。

1 綠原酸基本內(nèi)容與巨噬細胞源性泡沫細胞介紹

1.1 巨噬細胞源性泡沫細胞基本內(nèi)容

在攝入了大量的氧化低密度蛋白之后，巨噬細胞中會蓄積很多的脂質(zhì)細胞，長時間積累會讓巨噬細胞負荷過度導(dǎo)致出現(xiàn)泡沫細胞。泡沫細胞在形成之后也為之后出現(xiàn)動脈粥樣硬化情況奠定了基礎(chǔ)，也被認為是動脈粥樣硬化的早期步驟和重要標(biāo)志[2]。在已有的文獻當(dāng)中報道顯示，想要延緩動脈粥樣硬化在早期出現(xiàn)的病變，可以加速泡沫細胞的凋亡，也就是巨噬細胞凋亡的速度越快，動脈粥樣硬化發(fā)展的速度也就越慢。因此想要減少動脈粥樣硬化的病灶，或者延緩動脈粥樣氧化疾病的發(fā)展進程，這就需要減弱對巨噬細胞的抑制作用，加快巨噬細胞的凋亡。

TLR4即toll樣受體4，這一物質(zhì)存在于細胞膜上，在炎癥反應(yīng)、先天免疫以及獲得性免疫當(dāng)中均起到了十分關(guān)鍵的作用。已有的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TLR4在源性泡沫細胞形成的過程中，其表達水平會呈現(xiàn)出很明顯的升高趨勢[3]，表明在動脈粥樣硬化當(dāng)中。如果TLR4參與其中會讓泡沫細胞的炎性反應(yīng)能力得到提升。這間接表明了想要防止動脈粥樣硬化情況的出現(xiàn)，可以降低TLR4的表達水平。

1.2 綠原酸基本內(nèi)容

綠原酸是金銀花當(dāng)中的重要構(gòu)成部分，而金銀花本身則具有抗菌消炎作用。在相關(guān)學(xué)者的報道結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，采用中藥，包含金銀花在內(nèi)的中藥構(gòu)成的方劑對于動脈粥樣硬化易損斑塊的穩(wěn)定性具有比較好的作用[4]，之所以會起到穩(wěn)定斑塊的作用，很可能是因為其中包含的成分與抑制炎性反應(yīng)之間存在關(guān)系。學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)[5-6]，綠原酸在巨噬細胞中具有比較明顯的抗炎活性作用，起到抗炎作用的主要原因與機制還是因為幫助促進NF-κB水平的降低來實現(xiàn)的，當(dāng)然也會受到抗氧化酶的活性。研究理論成果體系當(dāng)中還比較缺少綠原酸與泡沫細胞之間的相關(guān)性分析，因此本次開展這方面研究可以起到填補理論空白的作用。

2 綠原酸對巨噬細胞源性細胞凋亡的作用及進展

2.1 綠原酸的作用分析

綠原酸可以對細胞起到一定的調(diào)控作用，也有不少學(xué)者在研究當(dāng)中對綠原酸的作用進行分析還得到相應(yīng)的研究成果。劉嫻等[7]分析了杜仲綠原酸（CA）對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞（HRECs）凋亡和炎癥反應(yīng)的影響，結(jié)果顯示綠原酸通過抑制NF-κB P65活化減弱LPS誘導(dǎo)的HRECs細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的增強。蘇國瑩等[8-9]對咖啡酸和綠原酸抑制AGEs誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)進行描述，考察AGEs-BSA、咖啡酸、綠原酸的合理作用濃度范圍，構(gòu)建HUVEC炎癥反應(yīng)體系?；魰苑嫉萚10-12]分析了綠原酸對于脂多糖的誘導(dǎo)，對于巨噬細胞所產(chǎn)生的影響，認為綠原酸之所以具備抗炎作用，可能與能夠促進NF-κB p65的水平的降低，對于一氧化氮的表達起到抑制作用有關(guān)，也可能是因為讓抗氧化酶活性出現(xiàn)了明顯增加的關(guān)系。張潔瓊等[13]研究認為拉帕替尼與綠原酸聯(lián)合應(yīng)用對于巨噬細胞的M2性極化以及抗乳腺癌轉(zhuǎn)移可以起到比較好的作用。

2.2 綠原酸對于巨噬細胞源性細胞凋亡的影響及作用

2.2.1 實驗設(shè)計和開展 ?有學(xué)者對于綠原酸在巨噬細胞源性細胞凋亡當(dāng)中的作用開展了相關(guān)的試驗，而且也得到了具體的研究成果[14-15]。研究對象選擇8周齡的小鼠，實行安樂死。在腹腔當(dāng)中注射RPMI，劑量為8 mL進行灌洗，對腹腔巨噬細胞進行收集，然后再采用青-鏈霉素來進行培養(yǎng)，時間為4 h，非貼壁細胞采用PBS來將其洗掉，巨噬細胞采用oxLDL預(yù)處理1 h。在對巨噬細胞的活性進行檢測時采用MTT法，等細胞貼壁之后，再對巨噬細胞采用L0×LDL來進行預(yù)處理，將不同濃度的綠原酸加入其中，培養(yǎng)2 d。在37℃的環(huán)境下，加入MTT溶液，孵育4 h，將孔中的液體都移除，將DMSO加入其中，溶解細胞當(dāng)中的MTT結(jié)晶。細胞凋亡所采用的方法是流式細胞式檢測，在接受預(yù)處理之后再加入不同濃度的綠原酸，接受49 h的培養(yǎng)，按細胞凋亡檢測的試劑盒說明書完成操作。

2.2.2 相關(guān)機制分析 ?通過研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化是心血管疾病的所有病變當(dāng)中最容易發(fā)生的病變[16]。動脈脂質(zhì)斑塊是因為脂質(zhì)沉積所導(dǎo)致的，一般包含了參與到炎癥反應(yīng)當(dāng)中的白細胞、內(nèi)皮細胞以及泡沫細胞等構(gòu)成。在關(guān)于動脈粥樣硬化的相關(guān)原因分析當(dāng)中可以發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞作為動脈粥樣硬化的高危影響因素是最早被發(fā)現(xiàn)的。巨噬細胞在動脈粥樣硬化發(fā)生病變的過程中，會產(chǎn)生不同數(shù)量的促炎癥因子，這些因子可以參與到脂質(zhì)沉積當(dāng)中，還會表達模式識別受體，所識別的受體有Toll樣受體和清道夫受體等[17]。研究中發(fā)現(xiàn)，在巨噬細胞源性泡沫細胞的形成過程中，TLR4的表達水平會呈現(xiàn)出十分明顯的升高趨勢，這一結(jié)果也證實了泡沫細胞和TLR4水平之間存在著一定的關(guān)系。TLR4水平對于炎癥信號通路會起到調(diào)控和激活的作用，導(dǎo)致病變部位的不斷加重，進一步誘發(fā)病變部位出現(xiàn)更嚴重的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致病變不斷惡化。所以，在動脈粥樣硬化疾病的預(yù)防和治療過程中就需要最大限度減少TLR4表達水平，促進源性泡沫細胞的數(shù)量降低[18]。

有學(xué)者在研究當(dāng)中提出了假說，即在泡沫細胞的形成過程中，OxLDL起到了十分重要的作用，如影響到一氧化碳信號通路情況和白細胞聚集黏附因子的釋放也會產(chǎn)生影響[19]。在黏附蛋白多糖的作用下，血管內(nèi)膜中會進入低密度脂蛋白，促進氧化修飾過程的有效完成。在修飾了脂質(zhì)之后，便可以相應(yīng)地誘導(dǎo)巨噬細胞，血管壁細胞釋放粘附因子，對于釋放炎癥因子也會起到誘導(dǎo)作用，觸發(fā)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，加重患者體內(nèi)的脂質(zhì)斑塊損傷程度，讓動脈粥樣硬化的程度不斷加重。金銀花是我國中藥中具有清熱解毒作用的中藥，在抗菌消炎當(dāng)中綠原酸起到了十分重要的作用。在文獻中指出，在巨噬細胞模型當(dāng)中，綠原酸具備了抗原活性，能幫助NF-κB表達水平的降低，也會對一氧化碳的釋放起到抑制作用。激活了TLR4信號通路之后，MyD88蛋白會和TLR4結(jié)合起來，形成十分重要的復(fù)合體，將體內(nèi)的其他物質(zhì)激活，對于NF-κB水平的降低需要先降解IκB。

2.2.3 綠原酸對凋亡細胞的調(diào)控作用研究進展 ? 關(guān)于綠原酸對于細胞凋亡的誘導(dǎo)作用相關(guān)研究已經(jīng)取得了不小的進展，在對已有學(xué)者開展研究結(jié)果的匯總分析當(dāng)中選擇了比較具有代表性的觀點進行分析。其中林茂等[20]研究綠原酸（CGA）對β淀粉樣蛋白_（25-35）（Aβ_（25-35））誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡的保護作用和機制，20 μmol/L的Aβ_（25-35）誘導(dǎo)PC12細胞構(gòu)建細胞損傷模型，并以5個不同濃度CGA干預(yù)，CCK-8法檢測細胞存活率以確定后續(xù)實驗CGA的3個濃度。隨后，細胞隨機分為Control組、Model組及3個濃度CGA組。最終得到結(jié)論，認為綠原酸對于所選擇的這種細胞凋亡具有比較好的改善作用，還可以幫助細胞抗氧化能力的改善，線粒體也會受到一定的損傷。劉哲等[21]研究了骨髓間充質(zhì)細胞來源軟骨樣細胞的相關(guān)內(nèi)容，分析了綠原酸對于此種細胞所產(chǎn)生的影響以及具體的影響機制，在實際開展研究當(dāng)中對大鼠的間充質(zhì)肝細胞采用體外培養(yǎng)的方式，借助于誘導(dǎo)液（包含有0.2 mg的L-1 BMP-2），讓細胞變成軟骨樣細胞之后再開展進一步的研究，分為（A）正常對照組、（B）綠原酸組、（C）0.1%O2缺氧環(huán)境組、（D）綠原酸+0.1%O2缺氧環(huán)境組。最終通過試驗發(fā)現(xiàn)，缺氧環(huán)境組中綠原酸所起到的作用比較明顯，也就意味著在缺氧環(huán)境下對于軟骨樣細胞凋亡的誘導(dǎo)作用十分明顯，產(chǎn)生誘導(dǎo)作用的機制可能是因為能夠讓細胞當(dāng)中的活性氧水平降低，對線粒體膜電位可以起到比較好的保護作用，對于Caspase-3的表達產(chǎn)生抑制作用，對于凋亡抑制基因也可以起到促進作用[22-23]。李欣穎[24]研究分析了酰基化ghrelin對棕櫚酸誘導(dǎo)的人源單核巨噬細胞（THP-1巨噬細胞）TLR4/NF-κB信號通路的作用用不同濃度的棕櫚酸（100 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L）孵育THP-1巨噬細胞株12 h;用不同濃度的酰基化ghrelin（1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L）孵育THP-1巨噬細胞株4 h后，再加入棕櫚酸（200 μmo1/L）孵育12 h，測定結(jié)果。最終通過研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞TLR4/NF-κB上信號通路的活化而促進炎癥因子分泌不僅僅會受到綠原酸的影響和調(diào)控，同時還會受到棕櫚酸的影響與調(diào)節(jié)。

在對與綠原酸抑制TLR4/NF-κB通路誘導(dǎo)巨噬細胞源性泡沫細胞凋亡作用的相關(guān)內(nèi)容進行分析的過程中發(fā)現(xiàn)與此相關(guān)的研究成果的確是很少見，而林慶新[25]在這方面所開展的研究比較完整，分析也更加全面一些。其以氧化低密度脂蛋白（OxLDL）誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細胞為巨噬細胞源性泡沫細胞，不同濃度的綠原酸對源性泡沫細胞的影響進行對比分析，還借助流式細胞術(shù)的方式來分析細胞凋亡程度和綠原酸之間的關(guān)系。用Western Blot法檢測綠原酸對凋亡相關(guān)蛋白表達的影響，最終通過研究發(fā)現(xiàn)在巨噬細胞源性泡沫細胞生長當(dāng)中綠原酸能夠起到比較好的誘導(dǎo)凋亡作用，表明在動脈粥樣硬化的預(yù)防與治療中可以考慮綠原酸的作用。

綜上所述，導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生的重要原因之一就是動脈粥樣硬化，而巨噬細胞源性泡沫細胞與動脈粥樣硬化之間又存在著十分密切的相關(guān)性。在臨床上想要更好地預(yù)防與治療心血管疾病，從根本上看需要控制好巨噬細胞源性泡沫細胞的生長，已有的研究證明了綠原酸對于巨噬細胞源性泡沫細胞的凋亡可以起到比較好的幫助作用，減少動脈粥樣硬化病灶的數(shù)量，也可以幫助延緩病程發(fā)展的速度，讓患者的生存率得到提升。

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（收稿日期：2019-12-04）