姜巖世，張永祥，劉利平，劉力，王鵬杰，王然

（1.西藏高原之寶牦牛乳業(yè)股份有限公司，拉薩 610000；2.三河福成生物科技有限公司，廊坊 065201；3.中國農業(yè)大學營養(yǎng)與健康系，北京 100083）

潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis）是一種非特異性炎癥性腸病，臨床上主要表現為腹痛、腹瀉、黏液膿血便[1]，具有難治性且極容易復發(fā)，并存在癌變風險，故被世界衛(wèi)生組織列為現代難治病之一[2]。UC發(fā)病機制尚不明確，與腸道通透性增加、炎癥反應、免疫和腸道菌群紊亂等多種因素相關[3]。

益生菌能夠降低腸道通透性、調節(jié)腸道菌群和免疫系統(tǒng)，因此，對UC具有潛在的治療效果[4]。研究表明，雙歧桿菌三聯(lián)活菌可以通過影響緊密連接蛋白的表達和分布來增強腸道屏障的完整性，防止病原菌和化學物質對其破壞[5]。嬰兒雙歧桿菌能夠增加腸道上皮細胞中緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達，從而增強上皮細胞的屏障功能，并改善IL-10敲除小鼠的結腸炎癥狀[6]。益生菌的代謝產物，如短鏈脂肪酸、過氧化氫、細菌素、抗菌活性肽等，可以有效減少腸內有毒物質氨和胺的產生，同時抑制外毒素的生成，減少腸道致病菌對腸道的傷害，維持腸道菌群的正常平衡，達到預防和減輕UC發(fā)病的效果[7]。

本研究以分離自西藏牦牛乳的動物雙歧桿菌NMC為研究對象，體外評價其耐酸耐膽鹽能力，并利用DSS誘導Balb/C雄性小鼠構建UC模型，探討其對UC的預防能力，為相關益生菌產品的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 菌株

動物雙歧桿菌NMC，中國微生物菌種保藏中心保藏，CGMCC No.12944。

1.1.2 材料

葡聚糖硫酸鈉（DSS），美國MP Biomedicals公司；酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA）試劑盒，美國Ebioscience公司；anti-ZO-1、anti-Occludin、anti-E-cadherin，美國Abcam公司；兔抗鼠酶標二抗，中國Beyotime公司；8周齡SPF級Balb/C野生型雄性小鼠，購買于北京維通利華試驗動物技術有限公司；維持飼料購買于北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.3 儀器

CKX-41型光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司；Milli-Q Biocel型超純水系統(tǒng)，美國MilliPore公司；PB3002-N型電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；石蠟切片機，德國Leica公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 耐酸、耐膽鹽測定[8]

將菌株以1%接種量接種傳代并進行厭氧培養(yǎng)，每代培養(yǎng)12h，在第二代培養(yǎng)12h后，將菌液在4 500r/min條件下離心10min，把菌體分別重懸于pH3（鹽酸調節(jié)pH）的MRSC培養(yǎng)基和膽鹽濃度為0.3%的MRSC培養(yǎng)基中，在0、1、2、3、4h時測其活菌數，并計算存活率（存活率=最終活菌數/初始活菌數）。

1.2.2 急性潰瘍性結腸炎動物模型的建立[9]

8周齡SPF級Balb/C野生型雄性小鼠50只，適應性喂養(yǎng)1周后，小鼠隨機分為5組，每組10只，分別為對照組、模型組、菌低劑量組（NMCL組）、菌中劑量組（NMCM組）、菌高劑量組（NMCH組）。對照組在整個試驗期間灌胃生理鹽水；試驗前7d，模型組灌胃生理鹽水，各菌劑量組分別灌胃0.2mL不同濃度的菌液，小鼠每天的灌胃劑量分別為5×108CFU/kg、5×109CFU/kg和5×1010CFU/kg；從第8天開始，除對照組外，各組在灌胃同時自由飲用2.5% DSS溶液，為期7d，造成試驗性結腸炎模型，造模期間每日觀察小鼠的一般狀況、體質量、大便性狀和隱血情況。

1.2.3 小鼠結腸炎疾病活動指數（disease activity index，DAI）評分

造模過程中觀察并記錄小鼠體重變化、糞便性狀及大便隱血/肉眼血便情況，并按表1進行DAI綜合評分[10]。

表1 DAI評分標準

1.2.4 結腸長度測量

試驗14d結束后脫頸處死小鼠，取出肛門至盲腸末端的整個腸斷，觀察結腸的外觀形態(tài)，并測量長度。

1.2.5 結腸組織病理分析

取結腸遠端炎癥反應明顯處約1cm的結腸組織，于10%的甲醛中固定72h后，用乙醇作脫水劑除去組織中的水分，于二甲苯中透明后用石蠟包埋，固定于切片機上切成薄片，進行蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin,HE）染色。以盲法觀察腸黏膜損傷情況，并進行組織學損傷評分。

1.2.6 結腸組織炎癥因子檢測

利用ELISA法測定小鼠結腸組織中的促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6水平，試驗操作步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.7 數據統(tǒng)計

采用SPSS 21.0單因素方差分析進行統(tǒng)計學分析，計數資料數據以平均值±標準差（±s）表示，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與討論

2.1 耐酸、耐膽鹽評價

雙歧桿菌等益生菌必須具有強的耐高胃酸和耐高膽鹽的能力，才能活著到達腸道發(fā)揮益生作用。研究表明，胃液的pH值為3左右，十二指腸的膽鹽濃度為0.3g/kg左右[11,12]，本試驗以pH值為3（鹽酸調節(jié)pH）和膽鹽濃度為0.3%模擬人體腸道環(huán)境，研究動物雙歧桿菌NMC對胃酸和膽鹽的耐受能力。如圖1所示，在pH 3.0條件下培養(yǎng)1～4h，動物雙歧桿菌NMC活菌數發(fā)生下降，培養(yǎng)4h與0h相比活菌數下降一個數量級，下降幅度較小，證明該菌株對胃酸具有良好的耐受性。在0.3%的膽鹽濃度下培養(yǎng)1～4h，在前3h內活菌數變化不大，第4h，活菌數發(fā)生顯著下降，與0h相比活菌數下降2數量級，下降幅度較小，證明該菌株對膽鹽具有良好的耐受性。

圖1 動物雙歧桿菌NMC對酸和膽鹽的耐受性

2.2 結腸炎疾病活動指數

試驗結束后對小鼠進行DAI綜合評分，結果如表2所示，模型組小鼠DAI評分最高，為8.81±2.25，顯著高于對照組（P＜0.05），表明小鼠造模成功；經動物雙歧桿菌NMC處理后，各組小鼠的DAI評分有不同程度降低，低、中、高劑量組分別為6.56±1.35、4.37±0.95、3.89±0.99，各劑量組DAI分數均顯著低于模型組（P＜0.05），表明動物雙歧桿菌NMC對UC具有一定的預防作用。

2.3 小鼠結腸情況及長度的變化

圖2 各組小鼠結腸長度

本試驗結束后解剖小鼠，對照組小鼠結腸組織完好、腸腔內糞便成形；模型組結腸腸腔內可見不成形暗紅色血便；動物雙歧桿菌NMC各組小鼠腸腔內出血減少，糞便基本成形。對照組小鼠結腸長度最長，為11.2±0.8cm，模型組最短，為7.8±0.6cm，NMC低、中、高劑量組分別為8.7±0.5cm、9.5±0.7cm和10.9±0.5cm，與模型組相比，均有顯著增加，其中高劑量組結腸長度與對照組相比沒有顯著差異（圖2），表明動物雙歧桿菌對潰瘍性結腸炎導致的小鼠結腸長度的縮短有抑制作用，并呈劑量依賴性。

2.4 小鼠結腸組織病理學炎癥評分

UC的病變多累及直腸和遠端結腸，結腸黏膜出現彌漫性炎性細胞浸潤和多發(fā)性潰瘍[13]。小鼠結腸組織病理切片HE染色如圖3所示，對照組小鼠的結腸黏膜結構完整，杯狀細胞正常，隱窩正常，腺體排列整齊，未見黏膜潰爛，無炎性細胞的浸潤，其組織病理學炎癥評分為0；模型組小鼠結腸黏膜組織損傷明顯，黏膜嚴重缺損、出血、腺體紊亂、隱窩破壞，炎癥細胞浸潤嚴重，深度達整個黏膜層，組織病理學炎癥評分為9.8±1.5，表明造模成功；動物雙歧桿菌NMC處理后，結腸黏膜損傷減輕，腺體、隱窩破壞減輕，炎性細胞浸潤減輕，低、中、高劑量組評分分別為6.5±1.1、4.8±0.9和4.2±0.5，顯著低于模型組（表2），表明該菌能夠預防小鼠結腸組織損傷，并具有劑量依賴性。

圖3 小鼠結腸組織HE切片

表2 各組小鼠DAI評分及結腸組織病理評分

2.5 小鼠結腸組織炎癥因子的變化

受損的腸黏膜上浸潤的大量炎性細胞可分泌炎癥因子，進而對腸黏膜造成損傷，放大炎癥反應[14]。本研究利用ELISA法測定了小鼠血清中的炎癥因子水平，結果如圖4所示。與對照組相比，模型組中促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的表達量顯著升高（P＜0.05），表明UC可導致小鼠血清中促炎因子的表達量升高；與模型組相比，經動物雙歧桿菌NMC干預后，低、中、高劑量組促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-6的表達量顯著下降，并呈劑量依賴性，表明動物雙歧桿菌NMC能夠抑制促炎因子的表達，降低腸上皮細胞的損傷，進而預防UC的發(fā)生和發(fā)展。

圖4 各組小鼠血清中促炎因子的表達

3 結論

本研究探討了動物雙歧桿菌NMC的耐酸耐膽鹽能力及預防UC的作用。結果表明，動物雙歧桿菌NMC在pH3.0，0.3%膽鹽濃度環(huán)境下具有良好的耐受性。在利用DSS誘導小鼠建立UC模型時，動物雙歧桿菌NMC可顯著降低UC小鼠DAI評分，緩解結腸長度縮短，緩解結腸黏膜損傷和炎癥細胞浸潤，降低結腸組織病理評分，降低促炎因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的表達，從而預防UC的發(fā)生和發(fā)展。