張 聰，杭立峰，陳 軍，詹 翔，金 雷，余 躍

胰腺癌(pancreatic cancer, PC)是一種高度惡性的消化道腫瘤，發(fā)現(xiàn)時往往已經(jīng)處于腫瘤晚期，對于中晚期PC臨床治療以化療為主[1-2]。阿霉素作為一種經(jīng)典的化療藥物，但在體內(nèi)容易被清除[3-5]。近年來，納米載藥體系可以增強藥物體內(nèi)循環(huán)時間引起了廣泛關(guān)注[6-7]。

光熱療法(photothermal therapy, PTT)是利用光誘導(dǎo)劑在電磁輻射作用下使得腫瘤局部升溫從而殺傷腫瘤細(xì)胞的一種新型腫瘤治療方法，在腫瘤治療領(lǐng)域已經(jīng)取得廣泛進展[8-9]。在腫瘤治療過程中，單獨的化療往往并不理想，已有文獻[10]報道通過結(jié)合PTT來實現(xiàn)化療增敏。硫化銅(copper sulphide, CuS)納米顆粒作為光熱治療劑引起了廣泛的關(guān)注[11]。但是由于CuS表面積較小難以攜載藥物[12-13]，該研究旨在通過優(yōu)化制備方法得到可以攜載阿霉素的空心CuS納米顆粒，同時與PTT相結(jié)合進而實現(xiàn)對PC細(xì)胞的化療增敏殺傷效果，為胰腺癌的臨床治療提供進一步的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料阿霉素鹽酸鹽(doxorubicin, DOX) 購自北京華豐有限公司；BxPC-3人源PC細(xì)胞株購自上海細(xì)胞庫；噻唑藍(lán)[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]購自美國Sigma-Aldrich公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司；血清購自美國Hyclone公司；空心CuS顆粒由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院杭立峰博士饋贈。

1.2 方法

1.2.1納米顆粒的制備 將制備好的空心CuS顆粒及PEG按質(zhì)量比1 ∶1在水溶液中進行共同孵育12 h后，離心即可獲得PEG修飾的CuS顆粒。通過將PEG-CuS顆粒與DOX共孵育，采用攪拌等方式成功將DOX包載于空心CuS顆粒中。

1.2.2納米顆粒粒徑及血清穩(wěn)定性檢測 分別將100 μl制備好的空心CuS顆粒溶液加入到不同的比色皿中，用動態(tài)光散射儀(dynamiclight scatterometer，DLS)來檢測納米顆粒尺寸，溫度控制在25 ℃，重復(fù)3次測量。為了了解CuS及PEG修飾后的CuS顆粒是否能在血清中穩(wěn)定存在，將其加入含10%胎牛血清的RPMI-1640溶液中邊孵育邊緩慢攪拌，然后用DLS分別檢測不同納米顆粒在相應(yīng)時間點的納米顆粒粒徑大小，分析其在血清中穩(wěn)定性。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng) 人源PC細(xì)胞系BxPC-3使用含有1%的雙抗及10%的胎牛血清的1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，37 ℃、5% CO2溫箱進行孵育。當(dāng)細(xì)胞密度長到培養(yǎng)皿的70%～80%時，使用胰酶(0.25%)進行消化、傳代、種板等。

1.2.4ICP-MS檢測PEG-CuS顆粒攝取情況 BxPC-3細(xì)胞種植入24孔板中，每孔種植10萬細(xì)胞，每組設(shè)置3個平行對照。溫箱中孵育24 h后，加入PEG-CuS顆粒進行孵育。在溫箱孵育2、4、6 h后取出培養(yǎng)板，吸去舊的含有顆粒和納米藥物的培養(yǎng)基，向板中各孔使用500 μl 1×PBS緩沖液清洗3次，充分洗去孔板中藥物殘留。接下來向每孔中加入200 μl胰酶進行消化，CO2溫箱孵育3～5 min后終止消化，消化后將其轉(zhuǎn)移至玻璃瓶中，加入硝酸300 ℃高溫蒸煮，反復(fù)蒸煮3次后，加入王水(濃鹽酸 ∶濃硝酸=3 ∶1)溶解，MILI-Q進行定容，ICP-MS進行定量檢測。

1.2.5MTT法檢測不同納米藥物殺傷PC細(xì)胞效果 當(dāng)BxPC-3細(xì)胞密度長到培養(yǎng)皿的70%～80%左右時，BxPC-3細(xì)胞種植入96孔板中，每孔種植5 000細(xì)胞，CO2溫箱孵育過夜，棄去舊培養(yǎng)基，實驗共分為3組，分別是CuS納米顆粒組、阿霉素組、CuS包載阿霉素組。CuS組每孔分別加入濃度為100、50、25、12.5 μg/ml的CuS顆粒；DOX組分別加入濃度為10、5、2.5、1.25 μg/ml的DOX；CuS包載DOX采用100 μg/ml CuS包載后終濃度為5 μg/ml的DOX作為治療初始組，其余各組對半稀釋，依次為50 μg/ml CuS包載濃度為2.5 μg/ml DOX, 25 μg/ml CuS包載濃度為1.25 μg/ml DOX，12.5 μg/ml CuS包載濃度為0.625 μg/ml DOX。每組設(shè)置3個平行對照，不加任何藥物的孔設(shè)為空白對照組。PBS組，游離DOX組，CuS及CuS包載DOX組溫箱孵育4 h后均給予1 064 nm激光器處理，時間為5 min，功率為1 W/cm2。照射結(jié)束后溫箱孵育24 h。24 h后，每孔加入25 μl 5 mg/ml MTT溶液，孵育2～4 h后，棄去舊培養(yǎng)基，每孔加入100微升DMSO混勻，搖床震蕩1 h后，酶標(biāo)儀488 nm波長進行檢測。用軟件Excel 2013和GraphPad.Prism.V7.0.處理測好的對應(yīng)孔的吸光度(optical density, OD)值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(藥物細(xì)胞組OD值-空白對照組OD 值)/(非光照不加藥細(xì)胞組OD值-空白對照組OD值)×100%。

1.2.6死活細(xì)胞染色法檢測不同納米藥物對PC細(xì)胞殺傷效果 BxPC-3細(xì)胞種植入24孔板中，每孔種植1×105個細(xì)胞，實驗分為4組：PBS對照組、CuS組、游離DOX組及CuS包載DOX組。溫箱中孵育24 h后，分別加入濃度為100 μg/ml的CuS顆粒，濃度為5 μg/ml的DOX，CuS濃度為100 μg/ml包載后終濃度為5 μg/ml的DOX組進行孵育。在溫箱孵育4 h后，PBS組，游離DOX組，CuS及CuS包載DOX組溫箱孵育4 h后均給與1 064 nm激光器處理，時間為5 min，功率為1 W/cm2。根據(jù)死活染色試劑盒的具體步驟進行死活染色，倒置熒光顯微鏡下進行觀察。

2 結(jié)果

2.1 空心CuS顆粒的粒徑及血清中穩(wěn)定性首先通過DLS驗證顆粒的粒徑位于356.3 nm左右，如圖1A所示，之后使用PEG進行表面修飾后，PEG-CuS顆粒粒徑為209.8 nm左右，同時采用透射電鏡對PEG-CuS進行表征，如圖1B所示，PEG修飾后的CuS顆粒約200 nm左右，這與DLS下的結(jié)果相一致的。為了驗證顆粒在體內(nèi)的穩(wěn)定性，使用10%血清模擬體內(nèi)血液循環(huán)。通過將PEG-CuS顆粒置于10%血清中，可以看出顆粒的粒徑在一定范圍內(nèi)波動，可以驗證材料血清中穩(wěn)定存在的，如圖1C所示。

2.2 ICP-MS定量分析結(jié)果顯示BxPC-3細(xì)胞對納米顆粒在6 h時間點攝取最多在CO2溫箱中分別孵育2、4、6 h后，PEG-CuS顆粒與PC細(xì)胞孵育后，對細(xì)胞攝取量進行定量分析后，在2、4、6 h時間點，PC細(xì)胞對PEG-CuS的攝取率隨著時間的推移而提高，在4 h時間點(20.20%)攝取率高于2 h時間點(12.95%)(P<0.05，t=4.083)，在第6小時時間點攝取量(32.98%)高于第4小時(20.20%)(P<0.01,t=5.889),差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 MTT法顯示CuS包載阿霉素組在光熱情況下殺傷效果最好細(xì)胞水平上，分別將BxPC-3細(xì)胞與CuS及DOX、CuS包載DOX共孵育后進行光照處理(1 064 nm，1 W/cm2)，從MTT法及死活染色法去驗證殺傷效果。從圖2中可以看出，CuS包載阿霉素+光照(100 μg/ml CuS包載濃度為5 μg/ml的DOX組)這組殺傷效果最好，對PC細(xì)胞殺傷率高達(dá)88.3%，優(yōu)于單獨的CuS+光照治療組(100 μg/ml)的52.04%(F=711.6,P<0.000 1)及游離DOX組(5 μg/ml)的45.58% (F=711.6，P<0.000 1)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 死活細(xì)胞染色法檢測各治療組殺傷情況對各治療組細(xì)胞通過死活染色試劑盒進行染色，紅色細(xì)胞代表死細(xì)胞，綠色細(xì)胞代表活細(xì)胞。如圖3所示，之后通過對圖片中細(xì)胞存活率進行統(tǒng)計分析得出結(jié)論：CuS包載DOX組殺傷效果最強，優(yōu)于游離DOX組(P<0.000 1,F=201.8)及空心CuS組(P<0.000 1,F=201.8)。

圖1 納米顆粒的相關(guān)表征

圖2 空心CuS顆粒及游離DOX及CuS包載DOX對PC殺傷情況

圖3 死活染色法檢測各治療組殺傷情況

3 討論

PTT是近年來出現(xiàn)的一種有效的腫瘤治療技術(shù)。光熱劑被遞送到目標(biāo)細(xì)胞或組織，然后通過激光照射將吸收的光能轉(zhuǎn)化為熱能，導(dǎo)致癌細(xì)胞的熱消融[14-15]。CuS納米顆粒由于具有穩(wěn)定的近紅外吸收、低成本和高穩(wěn)定性等優(yōu)點，是一類很有前途的新型光熱劑[16-17]。

DOX作為一種經(jīng)典的殺傷腫瘤的化療藥，雖然取得了較強的殺傷腫瘤效果，但是也帶來了強烈的毒副作用，從而限制了其在臨床治療中的應(yīng)用。近年來，納米載藥體系引起了廣泛關(guān)注。納米載藥體系主要通過囊封、包埋、吸附等方式包載臨床藥物，包載后可以改善藥物水溶性，提高藥物的選擇性，增強藥物在腫瘤位置富集強度及減少藥物對正常組織的副作用等[18]。因此，本研究設(shè)計并制備得到空心CuS納米顆粒用于攜載化療藥DOX。細(xì)胞水平結(jié)果顯示，通過PEG修飾后的CuS納米顆粒隨著時間的推移PC細(xì)胞對其攝取率是提高的。接下來進一步通過MTT和死活染色結(jié)果均顯示通過化療與光熱聯(lián)合后，殺傷效果增強，對PC細(xì)胞殺傷率高達(dá)88.3%，證明了兩種方案結(jié)合的有效性。

綜上所述，本研究證明了CuS納米顆粒通過其空心結(jié)構(gòu)成功攜載阿霉素,一方面，通過PEG修飾后PC細(xì)胞對CuS攝取率隨著時間的推移而提高，而且有文獻報道通過PEG修飾后可以實現(xiàn)納米藥物的血液循環(huán)時間延長，并基于腫瘤部位的EPR效應(yīng)進一步實現(xiàn)腫瘤富集作用[19]；另一方面，通過與PPT療法相結(jié)合實現(xiàn)了對腫瘤殺傷的化療增敏作用。而通過PEG修飾的CuS納米顆粒在動物水平上是否與細(xì)胞水平保持一致，有待進一步研究。