灑曉亮，高之苑，張 蘭

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是由于胰島素分泌缺陷或胰島素功能障礙而導(dǎo)致的一組以高血糖為特征的內(nèi)分泌代謝性疾病[1]。隨著現(xiàn)代社會(huì)的發(fā)展，糖尿病病人數(shù)量呈逐年增加的趨勢(shì)。根據(jù)一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，糖尿病病人的心血管病發(fā)病率均高于非糖尿病病人，且與其年齡、性別等無關(guān)[2]。糖尿病合并冠心病作為糖尿病常見的心血管病變之一，同時(shí)也是導(dǎo)致糖尿病病人死亡的重要原因。中醫(yī)認(rèn)為飲食失調(diào)、七情內(nèi)傷、年邁體虛等因素皆可以導(dǎo)致其發(fā)生發(fā)展，臨床上多采用益氣養(yǎng)陰、活血化痰去瘀之法對(duì)其進(jìn)行治療。

太子參又名孩兒參、童參等，是石竹科植物孩兒參的干燥塊根，具有益氣健脾、生津潤(rùn)肺之功效，可降糖、降脂，并且對(duì)心肌細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用。赤芍為毛茛科植物芍藥或川赤芍的干燥根莖，可清熱涼血、散瘀止痛，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗血栓、降糖等作用，臨床上常重用其治療冠心病。太子參與赤芍兩藥配伍，益氣活血，可從根本上治療糖尿病合并冠心病。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(network pharmacology，NP)是一門基于系統(tǒng)生物學(xué)理論和多向藥理學(xué)理論，以整體性、系統(tǒng)性為研究特點(diǎn)，分析生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)并選取特定信號(hào)節(jié)點(diǎn)，進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)的新學(xué)科。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可用于預(yù)測(cè)或推斷小分子與基因、蛋白質(zhì)、代謝物等靶點(diǎn)和網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)性，進(jìn)而構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)，全面系統(tǒng)地闡明藥物對(duì)疾病的干預(yù)和影響，為中藥現(xiàn)代化的研究提供了新的思路與方向[3]。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，探討太子參、赤芍兩味中藥治療糖尿病合并冠心病的作用機(jī)制，旨在為其臨床和基礎(chǔ)研究提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 中藥化學(xué)成分及靶點(diǎn)信息的獲取 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)TCMSP(http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp)收集太子參、赤芍兩味中藥的全部化學(xué)成分，選取同時(shí)滿足口服吸收率(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18、半衰期(HL)≥4 h的化學(xué)成分作為其潛在的活性成分。并通過有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)PubChem(https：// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)以及查閱文獻(xiàn)獲得這些成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，將其保存為Smiles格式。將篩選出的潛在活性分子Smiles結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.swisstarget-prediction.ch/)，限定研究對(duì)象為人類(homo sapiens)，由此獲得與活性成分最相關(guān)的靶點(diǎn)信息。采用Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.uniprot.org/)對(duì)靶點(diǎn)蛋白的名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，挖掘太子參、赤芍兩味中藥的活性成分所對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)。

1.2 疾病靶點(diǎn)的篩選 在TTD(http：//www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.disgenet.org/web/ DisGeNET/menu)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//www.omim.org/)中，分別搜索疾病關(guān)鍵詞為糖尿病、冠心病，合并3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果，去除重復(fù)和假陽性靶點(diǎn)，篩選出糖尿病、冠心病相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。

1.3 中藥-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選 為明確糖尿病合并冠心病的疾病相關(guān)靶點(diǎn)與太子參、赤芍兩味中藥的潛在靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，將疾病相關(guān)靶點(diǎn)與中藥相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行交集，應(yīng)用Venny軟件(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)對(duì)糖尿病靶點(diǎn)、冠心病靶點(diǎn)與太子參、赤芍兩味中藥的作用靶點(diǎn)繪制韋恩圖，篩選出中藥活性成分-疾病共同作用靶點(diǎn)。將篩選得到的共同作用靶點(diǎn)在STRING平臺(tái)(https：//string-db.org/)構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)模型，其中蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens”，“highest confidence”設(shè)定為 >0.9，其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置不變，獲得中藥-疾病共同作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)出文件。并將該文件中node1、node2和Combined score信息導(dǎo)入Cytoscape軟件得到網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，同時(shí)利用“Network Analyzer”模塊分析PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩詤?shù)，計(jì)算整體網(wǎng)絡(luò)的“節(jié)點(diǎn)度值分布(node degree distribution)和介數(shù)中心性(betweenness centrality)”。度值(degree)和介數(shù)(betweenness)是判斷網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)重要性的兩個(gè)主要拓?fù)鋮?shù)，度值和介數(shù)越大，節(jié)點(diǎn)在該網(wǎng)絡(luò)就越重要。本研究選取度值和介數(shù)同時(shí)在中位數(shù)以上的靶點(diǎn)為“核心靶點(diǎn)”，研究核心靶點(diǎn)可能的作用機(jī)制。

1.4 靶點(diǎn)生物功能注釋及通路分析 為進(jìn)一步闡明上述篩選出的核心靶點(diǎn)基因的生物學(xué)功能以及在信號(hào)通路中的作用，通過Cytoscape軟件的ClueGO插件對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO-BP生物功能富集分析，探索太子參、赤芍治療糖尿病合并冠心病核心靶點(diǎn)的生物學(xué)過程。并利用DAVID平臺(tái)(https：//david. ncifcrf.gov/)，輸入核心靶點(diǎn)基因，選擇Pathway分析中KEGG Pathway，設(shè)定顯著性為P<0.05，進(jìn)一步尋找中藥-疾病核心靶點(diǎn)的KEGG(KEGG pathway analysis)代謝通路。應(yīng)用Cytoscape軟件繪制核心靶點(diǎn)-信號(hào)通路-生物功能互作網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié) 果

2.1 太子參、赤芍主要活性化合物及靶點(diǎn)的篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，以及對(duì)其ADME中 OB≥30%、DL≥0.18和HL≥4 h進(jìn)一步篩選，共收集6個(gè)太子參活性化合物，25個(gè)赤芍活性化合物。化合物詳細(xì)信息見表1。將活性化合物的Smiles格式上傳到Swiss Target Prediction，篩選出418個(gè)太子參作用靶點(diǎn)、1 124個(gè)赤芍作用靶點(diǎn)，充分體現(xiàn)了太子參、赤芍多成分、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制。通過對(duì)太子參、赤芍的作用靶點(diǎn)進(jìn)行匯總，去除重復(fù)靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)太子參和赤芍共有靶點(diǎn)451個(gè)。

2.2 太子參、赤芍與糖尿病合并冠心病共同作用靶點(diǎn)的選擇 通過對(duì) TTD、DisGeNET 和 OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，共獲得糖尿病的相關(guān)疾病靶點(diǎn)1 802個(gè)、冠心病的相關(guān)疾病靶點(diǎn)1 188個(gè)。將451個(gè)太子參和赤芍共有作用靶點(diǎn)與1 802個(gè)糖尿病相關(guān)疾病靶點(diǎn)和1 188個(gè)冠心病相關(guān)疾病靶點(diǎn)輸入Venny軟件繪制韋恩圖，三者取交集后獲得太子參、赤芍與糖尿病合并冠心病共同作用靶點(diǎn)173個(gè)。詳見圖1。

圖1 太子參、赤芍與疾病共同作用靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)與核心靶點(diǎn)分析 將上述共同作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)得到PPI互作網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖2。圖中共有173個(gè)相互作用節(jié)點(diǎn)、694條邊。利用Cytoscape軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)中所有點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)(度和介度中心度)進(jìn)行分析，拓?fù)鋮?shù)值大于中位數(shù)，即度≥6、介數(shù)中心度≥1.83×10-2，作為篩選核心關(guān)鍵靶點(diǎn)的條件，共篩選出49個(gè)核心靶點(diǎn)。包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)、轉(zhuǎn)錄激活因子-3 (STAT3)、過氧化物酶體增殖激活受體-γ(PPARG)、絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT1)、類固醇受體輔激活因子(SRC)、維甲酸類受體α(RXRA)、1-磷酸鞘氨醇受體1(S1PR1)等。

圖2 共同作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 核心靶點(diǎn)生物功能富集分析與KEGG通路分析 利用Cytoscape軟件的ClueGO插件對(duì)篩選出的49個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO-BP生物學(xué)功能富集分析，可見多個(gè)生物學(xué)功能與糖尿病合并冠心病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，其主要富集于對(duì)脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、活性氧物質(zhì)代謝過程(reactive oxygen species metabolic process)、循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程(vascular process in circulatory system)、肌肉細(xì)胞增殖(muscle cell proliferation)、血液循環(huán)調(diào)節(jié)(regulation of blood circulation)、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)(regulation of ERK1 and ERK2 cascade)、血管收縮(vasoconstriction)、蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、偶聯(lián)環(huán)核苷酸第二信使(G-protein coupled receptor signaling pathway，coupled to cyclic nucleotide second messengerg)、平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)(regulation of smooth muscle cell proliferation)以及血壓調(diào)節(jié)(regulation of blood pressure)。詳見圖3。

圖3 核心靶點(diǎn)GO-BP功能信息

利用DAVID平臺(tái)對(duì)篩選出的49個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析，獲得與核心靶點(diǎn)相關(guān)代謝通路38條，篩選出與糖尿病合并冠心病有關(guān)通路，結(jié)果表明太子參、赤芍可能主要通過脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路(adipocytokine signaling pathway)、ErbB 信號(hào)通路(ErbB signaling pathway)、間隙連接通路(gap junction)、焦點(diǎn)黏附通路(focal adhesion)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號(hào)通路(PPAR signaling pathway)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)信號(hào)通路(VEGF signaling pathway)、促黃體生成素釋放激素(GnRH)信號(hào)通路(GnRH signaling pathway)等發(fā)揮治療作用，詳見圖4。并利用Cytoscape軟件構(gòu)建太子參與赤芍核心靶點(diǎn)-生物功能-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，詳見圖5。

圖4 核心靶點(diǎn)KEGG通路分析

圖5 太子參與赤芍核心靶點(diǎn)-生物功能-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)(紫色節(jié)點(diǎn)為核心靶點(diǎn)；綠色節(jié)點(diǎn)為KEGG信號(hào)通路；粉色節(jié)點(diǎn)為主要生物功能)

3 討 論

中醫(yī)學(xué)根據(jù)糖尿病病人多飲、多食、多尿、消瘦的臨床表現(xiàn)，將其歸屬于“消渴”“消癉”“三消”等范疇，其首見于《素問·奇病論》：“此人必?cái)?shù)食甘美而多肥也，肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿，其氣上溢，轉(zhuǎn)為消渴”[4]。根據(jù)冠心病病人胸部悶痛，甚則胸痛徹背，背痛徹心，喘息不得臥等臨床表現(xiàn)，將其歸屬于“胸痹”“心痛”等范疇?！鹅`樞·五邪》中 “邪在心，則病心痛”[4]是對(duì)其最早的記載。現(xiàn)代醫(yī)家基于古籍中“消渴”“胸痹”的記載，提出了“消心病”“糖心病”等病名[5]?！鹅`樞·本臟》中云：“心脆則善病消癉熱中”[4]。漢代張仲景在《傷寒論》中曾提出“消渴，氣上撞心，心中疼熱”。宋代巢元方在《諸病源候論》中論述其為：“消渴重，心中痛”[6]。以上皆說明消渴常累及于心，心中痛為消渴之重癥，糖尿病與冠心病二者之間關(guān)系密切，常合而為病。對(duì)于其病因病機(jī)，歷代醫(yī)家認(rèn)為是因?yàn)闅怅巸商撊站靡鹛禎嵫霰宰栊拿}所致。臨床上糖尿病病人多以氣陰兩虛為主，血為氣之母，氣為血之帥，氣虛則無力推動(dòng)血液運(yùn)行，血不行則成瘀；陰虛則燥熱，日久灼津煉液生痰，津液枯竭，進(jìn)而形成血瘀，瘀血痹阻心脈，導(dǎo)致冠心病的發(fā)生。同時(shí)痰濁、血瘀也會(huì)反過來加重氣血、津液的虛損，使糖尿病合并冠心病病情加重，纏綿難愈。因此，在治療上多應(yīng)用益氣養(yǎng)陰、活血化痰去瘀之法對(duì)其進(jìn)行治療。太子參味甘、微苦，性平，歸脾、肺經(jīng)，可益氣健脾、養(yǎng)陰生津，常用于治療脾虛食欲不振、困倦乏力或病后虛弱、氣陰不足、津傷口渴等癥。赤芍味苦，性微寒，歸肝經(jīng)，具有清熱涼血、散瘀止痛等功效，可用于治療冠心病、心絞痛、急慢性肝炎等疾病。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，挖掘太子參、赤芍治療糖尿病合并冠心病的核心靶點(diǎn)，分別構(gòu)建了太子參-赤芍的主要活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)以及太子參-赤芍主要活性成分-核心靶點(diǎn)-生物功能-信號(hào)通路的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，從多個(gè)角度探索了太子參、赤芍兩味中藥治療糖尿病合并冠心病的作用機(jī)制。通過對(duì)太子參、赤芍主要活性成分及篩選作用靶點(diǎn)，共得到太子參6個(gè)、赤芍25個(gè)活性成分和451個(gè)作用靶點(diǎn)。通過對(duì)疾病靶點(diǎn)的篩選，共獲得糖尿病靶點(diǎn)1 802個(gè)、冠心病靶點(diǎn)1 188個(gè)。三者取交集后得到共有靶點(diǎn)173個(gè)，充分體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)的治療特點(diǎn)。通過構(gòu)建PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)以及核心靶點(diǎn)的篩選，得到49個(gè)核心靶點(diǎn)，其中相關(guān)活性最高的靶點(diǎn)基因有VEGFA、STAT3、PPARG、AKT1、SRC等。VEGFA是VEGF信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)因子，可啟動(dòng)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分裂和遷移，從而誘導(dǎo)血管生成，有利于病變血管內(nèi)膜的修復(fù)，維持內(nèi)膜完整性，在血管內(nèi)皮損傷機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用[7-8]。STAT3是JAK/STAT3信號(hào)通路的重要組成部分[9]，JAK/STAT3信號(hào)通路是細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑，可用于多種應(yīng)激反應(yīng)，包括缺血、缺氧和氧化應(yīng)激，在介導(dǎo)胰島素抵抗(IR)損傷心肌保護(hù)中發(fā)揮著重要作用。PPARG主要參與脂肪組織中脂質(zhì)攝取和脂肪形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活，其基因突變可引起IR[10]。AKT1可以調(diào)控胰島素PI3K-AKT信號(hào)通路[11]，SRC與胰高血糖素的調(diào)節(jié)有關(guān)[12]。

現(xiàn)代研究表明，糖尿病病人引起冠心病并發(fā)癥皆是由于糖與脂的代謝紊亂、血管內(nèi)皮功能障礙、高血壓等導(dǎo)致[13]。GO-BP生物功能富集分析發(fā)現(xiàn)，太子參、赤芍的核心靶點(diǎn)中有14個(gè)靶點(diǎn)參與了脂多糖的調(diào)節(jié)，14個(gè)參與了活性氧物質(zhì)的代謝過程，12個(gè)參與了血液循環(huán)的調(diào)節(jié)，11個(gè)參與血管收縮的調(diào)節(jié)，從而共同發(fā)揮治療糖尿病合并冠心病的作用。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)太子參、赤芍可通過脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、ErbB 信號(hào)通路、間隙連接通路、焦點(diǎn)黏附通路、PPAR信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、GnRH信號(hào)通路等發(fā)揮治療作用。糖尿病病人的血清中脂肪因子表達(dá)水平較高，其對(duì)糖脂代謝、胰島素分泌和心血管功能均有一定的調(diào)控作用[14-15]。ErbB 信號(hào)通路在維持心功能中發(fā)揮著重要作用，在心臟組織中神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(NRG-1)可結(jié)合ErbB4受體，與ErbB2受體形成異源二聚體，將受體C-末端上特定的酪氨酸殘基磷酸化，從而激活PI3K/Akt信號(hào)通路[16-17]。既往研究發(fā)現(xiàn)PPARG配體有胰島素致敏作用且與氨基酸代謝有關(guān)[18]。2010年10月20日美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)發(fā)出公告稱GnRH激動(dòng)劑類藥物可導(dǎo)致心血管病和糖尿病的發(fā)生率升高[19]，說明GnRH信號(hào)通路與糖尿病合并冠心病的發(fā)生有著重要聯(lián)系。太子參中含有多糖類、皂苷類、脂肪酸類、甾醇類等化學(xué)成分[20]，王琪等[21]研究發(fā)現(xiàn)太子參中太子參多糖成分可通過改善胰島素信號(hào)通路，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制胰島素抵抗和炎癥信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，起到改善糖代謝紊亂的作用。赤芍中含有單萜類、多糖、有機(jī)酸等化學(xué)成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有抗血小板聚集、抗血栓形成、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降低血糖的作用[22]。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)和方法，從多角度挖掘太子參、赤芍治療糖尿病合并冠心病的作用機(jī)制，體現(xiàn)了中藥多靶點(diǎn)、多通路的治療特色，符合中醫(yī)藥現(xiàn)代化的發(fā)展要求，為后續(xù)的臨床與基礎(chǔ)研究提供了新的思路。