吳 灃，譚子虎，彭金香

中醫(yī)藥在治療老年性癡呆(AD)方面的優(yōu)勢不斷凸顯，已成為防治老年性癡呆的重要組成部分。七福飲是由人參、熟地、當(dāng)歸、白術(shù)、炙甘草、棗仁、遠(yuǎn)志組成。七福飲功能為補(bǔ)益氣血、健脾安神，其藥理學(xué)機(jī)制包括改善認(rèn)知障礙、抗氧化、改善膽堿能神經(jīng)功能、減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡等[1-2]。許多系統(tǒng)性疾病如神經(jīng)退行性疾病不能通過單基因靶向策略有效治療，因?yàn)檫@些疾病涉及復(fù)雜的生物機(jī)制。老年性癡呆發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，單一靶向療法對(duì)于老年性癡呆的長期治療容易產(chǎn)生抵抗性，而采用多靶點(diǎn)的中藥治療可能更有效。七福飲已經(jīng)在臨床實(shí)踐中廣泛應(yīng)用，但七福飲的藥理機(jī)制仍未完全闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已經(jīng)成為一種綜合的系統(tǒng)方法，可以幫助解釋健康和疾病背景下的藥理數(shù)據(jù)[3]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將生物學(xué)特征與化學(xué)結(jié)構(gòu)特征聯(lián)系起來，并組建網(wǎng)絡(luò)模型，有助于破譯涉及藥物藥理作用的成分。一方面，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從細(xì)胞或表型網(wǎng)絡(luò)的角度分析藥物反應(yīng)；另一方面，基于化學(xué)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種很有前途的化學(xué)表征替代方法。兩者都可以為設(shè)計(jì)藥物和更好地了解藥物多重作用下的機(jī)制提供幫助?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法能明確七福飲所涵蓋的多個(gè)層次的作用。本研究擬使用藥物-靶標(biāo)-治療數(shù)據(jù)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)七福飲多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特征進(jìn)行系統(tǒng)研究，并揭示七福飲治療老年性癡呆的藥理作用及其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 化學(xué)成分信息 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/index.php)[4]、PubChem Compound數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/)，分別檢索人參、熟地、當(dāng)歸、白術(shù)、炙甘草、棗仁和遠(yuǎn)志的化學(xué)成分。以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18為限定條件，篩選收集化學(xué)成分-靶點(diǎn)信息。從 Genecards (https://www.genecards.org/)、OMIM(http://www.omim.org/)兩個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫檢索老年性癡呆相關(guān)靶點(diǎn)[5-6]。

1.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析 使用Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)進(jìn)行蛋白名與基因名轉(zhuǎn)換，將七福飲和老年性癡呆矯正后的基因取交集。將候選6種化合物和預(yù)測靶標(biāo)導(dǎo)入cytoscape3.7.1軟件，進(jìn)行成分-靶標(biāo)作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建[7]。通過構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)揭示七福飲治療老年性癡呆多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)。

1.3 靶點(diǎn)及通路注釋分析 利用DAVID(http://david.nifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫對(duì)得到的交集基因進(jìn)行GO注釋分析(gene-ontology)和KEGG通路分析(kyoto encyclopedia of genes and genomes)[8]。交集基因可以直接映射到通路上。

2 結(jié) 果

2.1 化學(xué)成分和靶點(diǎn)基因的收集 檢索得到七福飲中符合限定條件的化學(xué)成分：人參21種，熟地2種，當(dāng)歸2種，白術(shù)4種，炙甘草92種，棗仁9種，遠(yuǎn)志19種。刪除重復(fù)項(xiàng)共415種化學(xué)成分，包括豆甾醇、β-谷甾醇、阿樸天仙子堿、山奈酚等。七福飲的化學(xué)成分對(duì)應(yīng)130個(gè)基因，例如Ldl受體相關(guān)蛋白1(LDL receptor related protein 1，LRP1)、尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase plasminogen activator，PLAU)、富含亮氨酸重復(fù)片段的激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)、膜金屬肽鏈內(nèi)切酶(membranemetallo-endopeptidase，MME)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glialcellline-derived neurotrophic factor，GDNF)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyl transferase，ChAT)等。詳見表1。

表1 七福飲的部分代表性化學(xué)成分

2.2 老年性癡呆相關(guān)靶點(diǎn)通路信息 從兩個(gè)數(shù)據(jù)庫得到老年性癡呆相關(guān)基因264個(gè)，包括分揀蛋白相關(guān)受體1、淀粉樣前體蛋白、載脂蛋白E、微管相關(guān)蛋白Tau、腫瘤壞死因子、α-核蛋白、朊蛋白、白介素-1β、一氧化氮合酶3、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、組織蛋白酶D、膠質(zhì)纖維酸性蛋白等，DAVID分析得到有HIF-1信號(hào)通路、多巴胺突觸、FoxO信號(hào)通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等通路信息。詳見表2。

表2 老年性癡呆相關(guān)靶點(diǎn)的部分代表性通路

2.3 交集基因的生物分子功能注釋 將七福飲靶點(diǎn)基因和老年性癡呆的相關(guān)基因取交集，共有23個(gè)相關(guān)基因，包括PLAU、HMOX1、SLC6A4、CASP9、MAOB、AKT1、PTGS2、IL1B、SOD1、MAOA、ESR1、PON1、IFNG、PTGS1、MAPK8、ICAM1、CASP8、ACHE、GSK3B、PPARG、MAP2、SLC6A3、CASP3。對(duì)七福飲靶點(diǎn)基因和老年性癡呆的相關(guān)基因取交集后的23個(gè)基因通過DAVID6.7系統(tǒng)進(jìn)行生物分子功能注釋。交集基因在分子功能主要是對(duì)血紅素結(jié)合(heme binding)等，包括血紅素加氧酶1、前列環(huán)素G/H合成酶1等。交集基因主要分布在神經(jīng)元胞體、投射神經(jīng)元、細(xì)胞外間隙部位。相關(guān)基因糖有原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因(sodium-dependent dopamine transporter，SLC6A3)等。交集基因主要參與氧化應(yīng)激反應(yīng)、環(huán)氧酶途徑、多巴胺分解代謝等生物過程，包括前列環(huán)素G/H合酶2(prostaglandin G/H synthase2，PTGS2)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecular-1，ICAM-1)等基因參與其中。詳見表3。

表3 七福飲與老年性癡呆相關(guān)的靶點(diǎn)進(jìn)行GO注釋分析和KEGG通路分析

2.4 化學(xué)成分-交集基因-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 由KEGG分析，以P≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選通路，得到47條通路(甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、組氨酸代謝、組氨酸代謝被剔除)及18個(gè)基因(PON1、HMOX1、MAP2、ACHE和IL1B被剔除)。

采用Cytoscape軟件構(gòu)建化學(xué)成分-基因-通路網(wǎng)絡(luò)模型。作用于靶點(diǎn)和通路的化學(xué)成分有甘草酚、豆甾醇、β-谷甾醇、甘草甙、人參皂苷rh2、山萘酚等。其中甘草酚作用于PPARG、GSK3B、ESR1，豆甾醇作用于PLAU、SLC6A3、MAOB、MAOA，β-谷甾醇作用于SLC6A4、PTGS1、CASP9、CASP8、CASP3，甘草甙作用于SOD1，人參皂苷rh2作用于IFNG，山萘酚作用于AKT1、PPARG、MAPK8、ICAM1，七福飲主要活性成分的作用靶點(diǎn)涉及的通路有Toll樣受體信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號(hào)通路。

3 討 論

七福飲治療老年性癡呆的有效性已經(jīng)在臨床上得到證實(shí)[9-10]。但目前對(duì)七福飲治療老年性癡呆的藥理機(jī)制尚不明確。隨著分子生物學(xué)和基因組技術(shù)方面的發(fā)展，越來越多的數(shù)據(jù)已經(jīng)可用于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，醫(yī)學(xué)界的焦點(diǎn)將從藥物還原論轉(zhuǎn)向基于藥物整體系統(tǒng)的方法。將生物學(xué)特征與化學(xué)結(jié)構(gòu)特征連接成一個(gè)基于網(wǎng)絡(luò)的模型有助于全面研究有關(guān)七福飲中藥藥理作用的成分?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路可以從分子和細(xì)胞水平到組織和生物體水平，分析七福飲治療老年性癡呆的作用機(jī)制。

在七福飲組方的化學(xué)成分甘草酚作用于PPARG、GSK3B、ESR1三個(gè)靶點(diǎn)，豆甾醇作用于PLAU、SLC6A3、MAOB、MAOA四個(gè)靶點(diǎn)，β-谷甾醇(beta-sitosterol)作用于SLC6A4、PTGS1、CASP9、CASP8、CASP3五個(gè)靶點(diǎn)，甘草甙作用于SOD1，人參皂苷rh2作用于IFNG。七福飲組方的多個(gè)化學(xué)成分也可以對(duì)應(yīng)一個(gè)共同靶點(diǎn)，如甘草酚、山萘酚共同作用于 PPARG。七福飲組方的化學(xué)成分參與多個(gè)信號(hào)通路，如Toll樣受體信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路和VEGF信號(hào)通路等。其中Toll樣受體信號(hào)通路參與免疫炎癥反應(yīng)和降低老年性癡呆模型小鼠海馬Aβ的表達(dá)。人類巨噬細(xì)胞吞噬Aβ是由G蛋白偶聯(lián)甲基肽受體1介導(dǎo)的。研究表明漢族人群TLR9與老年性癡呆的發(fā)病相關(guān)，存在TLR9rs187084突變純合子GG人群的遲發(fā)性老年性癡呆患病風(fēng)險(xiǎn)明顯降低[11]。

總之，七福飲組方通過甘草酚、豆甾醇、β-谷甾醇、甘草甙、人參皂苷rh2、山萘酚等多個(gè)化學(xué)成分作用于Toll樣受體信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路和VEGF信號(hào)通路等多個(gè)信號(hào)通路。表明七福飲組方及其化學(xué)成分可能直接作用于老年性癡呆關(guān)鍵的通路靶點(diǎn)，為進(jìn)一步深入揭示七福飲治療老年性癡呆的藥理機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。