邵金金，劉新艷

糖尿病腎病是糖尿病的慢性微血管并發(fā)癥之一，蛋白尿是糖尿病腎病的主要臨床表現(xiàn)，若病情持續(xù)進(jìn)展，最終發(fā)展為慢性腎衰竭。腎小球?yàn)V過屏障受損是蛋白尿產(chǎn)生的主要因素，而足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分，足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性與蛋白尿的產(chǎn)生關(guān)系密切。高糖引起的足細(xì)胞損傷包括足細(xì)胞肥大、足細(xì)胞凋亡等。有研究表明，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制劑(如雷帕霉素)對(duì)高糖引起的足細(xì)胞損傷可能具有保護(hù)作用[1]。本研究觀察高糖誘導(dǎo)的小鼠腎足細(xì)胞增殖與凋亡、裂孔隔膜分子Podocin表達(dá)的變化以及新一代mTOR抑制劑PP242的干預(yù)作用，探討PP242對(duì)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，PP242 購(gòu)自美國(guó)Cayman公司，小鼠γ-干擾素購(gòu)于賽業(yè)生物，兔抗小鼠Podocin多克隆抗體、小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)于中杉金橋生物公司，胎牛血清購(gòu)于四季青公司。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司。PP242用二甲基亞砜(DMSO)溶解后，配制成100 mmol/L的儲(chǔ)存液，過濾以后進(jìn)行分裝，分裝好的PP242凍存。

1.2 足細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 小鼠腎足細(xì)胞購(gòu)于北納生物。足細(xì)胞首先培養(yǎng)于含10%胎牛血清、50 U/mL小鼠γ-干擾素的1640培養(yǎng)液中，置于33 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合度時(shí)，用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(含0.05%胰蛋白酶及0.02%EDTA)消化傳代，然后轉(zhuǎn)入不含γ-干擾素但含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化7～14 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 將足細(xì)胞分為4組。正常組給予葡萄糖5.5 mmol/L；高糖組給予葡萄糖30 mmol/L；PP242干預(yù)1組給予葡萄糖30 mmol/L、1 μmol/L PP242； PP242干預(yù)2組給予葡萄糖30 mmol/L、10 μmol/L PP242。

1.4 MTT法檢測(cè)足細(xì)胞增殖 取分化培養(yǎng)好的足細(xì)胞，用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，調(diào)至4×104/mL，然后接種在96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL細(xì)胞懸液；放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)呈亞融合狀態(tài)后，更換為無(wú)血清的1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞進(jìn)入靜止期G0期。按照分組情況，分別給予不同的干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h；于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入MTT液(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，于室溫下振蕩5 min，然后靜置10 min。將酶標(biāo)儀調(diào)至490 nm處，測(cè)定樣本吸光度A值(OD490)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)足細(xì)胞凋亡 取分化培養(yǎng)好的足細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至3×105/mL，然后接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL細(xì)胞懸液。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)呈亞融合狀態(tài)后，更換為無(wú)血清1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞進(jìn)入G0期。按照分組情況，給予不同的干預(yù)后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌貼壁細(xì)胞1次，消化細(xì)胞，收集培養(yǎng)細(xì)胞，1 000 g離心5 min，棄上清，PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取1×106重懸的細(xì)胞，1 000 g離心5 min，棄上清，加入195 μL的細(xì)胞結(jié)合液，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL 的碘化丙錠溶液，混勻后于室溫避光孵育15 min。采用流式細(xì)胞儀分析。

1.6 Western Blot檢測(cè)Podocin蛋白的表達(dá) 首先提取蛋白，培養(yǎng)并分組處理足細(xì)胞方法同1.5，收集標(biāo)本。用預(yù)冷的PBS洗滌足細(xì)胞2次，加入細(xì)胞裂解液，然后冰上裂解30 min，4 ℃離心，15 000 r/min離心10 min，吸取上清液。用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將變性后的蛋白樣品加樣，每孔30 μg，先電泳分離，后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，室溫下，以5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，用1∶200稀釋的Podocin多克隆抗體，1∶1 000稀釋GAPDH單克隆抗體，4 ℃孵育，過夜。用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，繼續(xù)孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影、定影。用SAGECREATION凝膠成像系統(tǒng)成像，用Lane 1D分析軟件對(duì)特異性條帶進(jìn)行灰度掃描，以Podocin蛋白條帶與GAPDH蛋白條帶的灰度比值表示Podocin蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 PP242對(duì)高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞分組培養(yǎng)48 h后，高糖組足細(xì)胞增殖明顯受到抑制，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與高糖組比較，PP242干預(yù)1組、PP242干預(yù)2組細(xì)胞增殖明顯升高(P<0.05)，且隨著PP242濃度的增大，作用更加明顯，呈一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。詳見表1。

表1 各組足細(xì)胞增殖的吸光度值(OD490)比較(±s)

2.2 PP242對(duì)高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞凋亡的影響 細(xì)胞分組培養(yǎng)48 h后，正常組足細(xì)胞凋亡率為(4.0±0.7)%，高糖組足細(xì)胞凋亡率為(18.8±0.6)%，高糖組足細(xì)胞凋亡率高于正常組(P<0.05)。高糖培養(yǎng)足細(xì)胞經(jīng)PP242干預(yù)后，足細(xì)胞凋亡率較高糖組明顯下降(P<0.05)，其中PP242干預(yù)1組足細(xì)胞凋亡率為(12.5±0.9)%，PP242干預(yù)2組足細(xì)胞凋亡率為(9.1±0.6)%，提示高濃度PP242干預(yù)后足細(xì)胞凋亡率更低。詳見圖1、圖2。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)足細(xì)胞凋亡情況

與正常組比較，*P<0.05；與高糖組比較，# P<0.05。

2.3 Western Blot檢測(cè)Podocin蛋白表達(dá)的變化 高糖培養(yǎng)足細(xì)胞48 h后，高糖組足細(xì)胞Podocin蛋白表達(dá)下降，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高糖培養(yǎng)并經(jīng)PP242干預(yù)后，PP242干預(yù)1組、PP242干預(yù)2組Podocin蛋白表達(dá)較高糖組明顯上升(P<0.05)。詳見圖3。

A：正常組；B：高糖組；C：PP242干預(yù)1組；D：PP242干預(yù)2組。與正常組比較，*P<0.05；與高糖組比較，# P<0.05。

3 討 論

目前認(rèn)為，糖尿病腎病引起的足細(xì)胞損傷，主要包括足細(xì)胞肥大、足細(xì)胞凋亡、足細(xì)胞脫離以及足細(xì)胞向上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化[2]。而高糖引起足細(xì)胞損傷的機(jī)制可能為氧化應(yīng)激損傷、微RNA、自噬以及外泌體等[3-4]。mTOR信號(hào)通路在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡中起重要作用[5]。mTOR是自噬的負(fù)性調(diào)控因子，而mTOR特異性抑制劑(如雷帕霉素)與mTOR特異性結(jié)合后，可抑制mTOR的蛋白激酶活性，通過增加自噬來(lái)維持足細(xì)胞的自身穩(wěn)態(tài)，抵御高糖的作用，減少細(xì)胞凋亡[6]。本研究旨在觀察新一代mTOR抑制劑PP242對(duì)高糖引起的足細(xì)胞損傷有無(wú)保護(hù)作用。

本研究結(jié)果提示，高糖培養(yǎng)足細(xì)胞后，足細(xì)胞增殖明顯減少，但同時(shí)加入PP242后，足細(xì)胞的細(xì)胞存活率較高糖組有所提高。高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞后，足細(xì)胞凋亡增加，經(jīng)PP242干預(yù)后，足細(xì)胞的凋亡率較高糖組降低。說(shuō)明PP242可在一定程度上減弱高糖對(duì)足細(xì)胞增殖抑制的影響，PP242也可減少高糖引起的足細(xì)胞凋亡。PP242也是一種自噬誘導(dǎo)劑，對(duì)腫瘤壞死因子-α所致的腸屏障損傷、多囊腎大鼠膽管上皮細(xì)胞都有誘導(dǎo)自噬的作用[7-8]。

在對(duì)糖尿病腎病的研究中發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞的裂孔隔膜受損、足突發(fā)生融合以及足細(xì)胞從基底膜脫落，導(dǎo)致大量蛋白尿的產(chǎn)生。雷帕霉素具有減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物蛋白尿的作用，可能與減少腎小球?yàn)V過屏障的通透性，上調(diào)Nephrin和Podocin蛋白的表達(dá)有關(guān)[9-10]。Nephrin、 Podocin與CD2AP 組成的復(fù)合體在維持裂孔隔膜結(jié)構(gòu)的完整性上起到了重要作用[11]。Podocin是NPHS2基因產(chǎn)物，Podocin在介導(dǎo)裂孔隔膜與足細(xì)胞骨架連接方面發(fā)揮整合的作用。以往研究表明，糖尿病腎病鼠腎臟Nephrin和 Podocin蛋白表達(dá)下降。高糖刺激足細(xì)胞后，也可以引起足細(xì)胞出現(xiàn)Nephrin和 Podocin蛋白表達(dá)下降[10，12]，與本研究結(jié)果一致。PP242可以部分恢復(fù)Podocin蛋白表達(dá)，從而維護(hù)裂孔隔膜的完整性。因此，對(duì)于高糖引起的腎小球足細(xì)胞增殖、凋亡的影響以及Podocin蛋白表達(dá)的變化，PP242都有一定程度的干預(yù)作用，具有潛在的足細(xì)胞保護(hù)作用。