呂惠生, 馮永鑫, 周錦怡, 張 佳, 耿中峰

(天津大學(xué) 石油化工技術(shù)開(kāi)發(fā)中心綠色合成與轉(zhuǎn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津 300072)

1 前 言

天然植物苦蕎富含蘆丁及山奈酚-3-O-蕓香糖苷2 種活性組分，二者具有獨(dú)特的藥理作用[1-3]。蘆丁組分能夠降低毛細(xì)血管脆性、改善微循環(huán)，臨床上用于高血壓、糖尿病等病癥的輔助治療；山奈酚-3-O-蕓香糖苷組分具有增加乙酰膽堿及單胺類神經(jīng)遞質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)等作用，對(duì)防治老年癡呆癥及心血管疾病療效顯著[4]。除含有蘆丁及山奈酚-3-O-蕓香糖苷等有效成份外，苦蕎還含有其他無(wú)效甚至有毒成份，采用現(xiàn)代提取技術(shù)使有效成分進(jìn)一步濃縮純化，生產(chǎn)保健品或醫(yī)藥單體，成為目前苦蕎高附加值利用的研究重點(diǎn)。其傳統(tǒng)的提純方法主要有堿提酸沉法[5]、大孔吸附樹(shù)脂法[6-7]及高速逆流色譜法[8]等，一般要求苦蕎活性組分產(chǎn)品純度≥90%[5]，存在工序繁瑣、收率低及溶劑殘留多等問(wèn)題[9]。

超臨界流體-模擬移動(dòng)床(supercritical fluid - simulated moving bed, SF-SMB)是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型工業(yè)色譜分離技術(shù)，具有分離效率高、制備條件溫和、溶劑殘留少及綠色環(huán)保等優(yōu)勢(shì)，在食品安全、藥品及制劑質(zhì)量控制及天然產(chǎn)物制備等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[10-12]。制備型超臨界色譜(supercritical fluid chromatography，SFC)是具有產(chǎn)品制備功能的生產(chǎn)裝置，在中草藥醫(yī)藥單體產(chǎn)品制備領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。本文擬以苦蕎粗提物為原料，開(kāi)展基于超臨界流體制備色譜技術(shù)的苦蕎活性組分提純工藝研究，考察夾帶劑、CO2流量、壓力、溫度及進(jìn)樣量等工藝條件對(duì)苦蕎活性組分分離度及保留因子的影響規(guī)律，確定適宜的工藝條件，建立保留因子模型，為采用SF-SMB 技術(shù)生產(chǎn)苦蕎活性組分產(chǎn)品提供工程化設(shè)計(jì)基礎(chǔ)工藝數(shù)據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)材料、設(shè)備及方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

苦蕎粗提物(天津普拉德生物科技有限公司)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.0%，大連美侖生物技術(shù)有限公司)，山奈酚-3-O-蕓香糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度 98.0%，大連美侖生物技術(shù)有限公司)，二氧化碳(純度 99.9%，天津浩倫氣體有限公司)，無(wú)水甲醇(分析純，科密歐化學(xué)試劑有限公司)，乙腈(色譜純，Merck 公司)，磷酸(色譜純，科密歐化學(xué)試劑有限公司)，蒸餾水(電阻率1.6×107?·cm-1，實(shí)驗(yàn)室自備)。

2.2 實(shí)驗(yàn)裝置及方法

苦蕎活性組分超臨界流體制備色譜提純工藝實(shí)驗(yàn)采用SFC-200 型制備型超臨界色譜裝置，采用的色譜柱為Zorbax SB-CN(9.4 mm×250 mm)，填料采用粒徑5 μm 的涂敷型硅膠，硅膠表面鍵合氰基基團(tuán)。圖1 為超臨界流體制備色譜提純工藝實(shí)驗(yàn)裝置流程圖。

圖1 超臨界流體制備色譜提純工藝實(shí)驗(yàn)裝置流程圖Fig.1 Experimental flow chart of purification by supercritical fluid preparation chromatography

實(shí)驗(yàn)步驟：配制質(zhì)量濃度為10 g·L-1的苦蕎粗提物甲醇溶液，采用0.45 μm 的微孔濾膜過(guò)濾溶液至澄清狀態(tài)，置于4 ℃下冷凍備用；開(kāi)啟紫外檢測(cè)器，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)，排空夾帶劑泵，設(shè)置水浴溫度；待水浴溫度達(dá)到設(shè)定值，開(kāi)啟自動(dòng)背壓閥，啟動(dòng)儀器工作站，設(shè)定CO2質(zhì)量流量及色譜柱壓力等參數(shù)，打開(kāi)CO2鋼瓶，待系統(tǒng)壓力穩(wěn)定后，開(kāi)啟CO2泵；色譜基線穩(wěn)定后，開(kāi)啟夾帶劑泵；色譜基線重新穩(wěn)定后，手動(dòng)進(jìn)樣10 μL 的苦蕎粗提物溶液，記錄各組分在SFC 的保留行為，每次改變實(shí)驗(yàn)參數(shù)后平衡20 min。

產(chǎn)品分析：采用Agilent-1100 型高效液相色譜儀分析蘆丁及山奈酚-3-O-蕓香糖苷組分，分析柱采用ZorBax SB-C18 柱(4.6 mm×250 mm I.D，5 μm)。分析條件：流動(dòng)相(90%乙腈+0.4%磷酸水溶液)體積流量1 mL·min-1、柱箱溫度40 ℃、進(jìn)樣量20 μL 及紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)360 nm。

實(shí)驗(yàn)方法：以分離度和保留因子等參數(shù)作為分離性能[13]的評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究夾帶劑、CO2質(zhì)量流量、溫度、壓力及進(jìn)樣量等工藝條件對(duì)活性組分分離度及保留因子的影響。實(shí)驗(yàn)條件：CO2質(zhì)量流量14～22 g·min-1、夾帶劑體積流量 3～5 mL·min-1、溫度 308.15～323.15 K、壓力 8～16 MPa 及進(jìn)樣量 15～25 μL。蘆丁與山奈酚-3-O-蕓香糖苷組分的分離度計(jì)算公式見(jiàn)式(1)[14]，保留因子計(jì)算公式見(jiàn)式(2)。

式中：R 為分離度；W1、W2分別為兩組分的色譜峰底寬，tR1、tR2分別為蘆丁和山奈酚-3-O-蕓香糖的保留時(shí)間。

式中：ki為不同組分的保留因子，k1、k2分別為蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷保留因子；tRi為不同溶質(zhì)保留時(shí)間，min，t0為色譜柱死保留時(shí)間，min。

為保證得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，要求每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行至少 3 組平行實(shí)驗(yàn)，允許實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差≤±5%。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論

圖2 不同夾帶劑及流量對(duì)苦蕎活性組分分離度的影響Fig.2 Effects of entrainers and flow rates on separation resolution of tartary buckwheat active components

3.1 夾帶劑的影響

蘆丁與山奈酚-3-O-蕓香糖苷屬于黃酮類化合物，極性較大，非極性的超臨界二氧化碳(SC-CO2)對(duì)極性溶質(zhì)的溶解度較小，一般通過(guò)加入甲醇或乙醇作為夾帶劑提高流動(dòng)相對(duì)溶質(zhì)的溶解能力[12]。此外，對(duì)于黃酮類化合物，在夾帶劑中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.2% 的磷酸，可以有效改善色譜峰峰形，提高組分分離度[15]。在溫度313.15 K、壓力12 MPa、CO2質(zhì)量流量20 g·min-1及夾帶劑體積流量 3～5 mL·min-1的條件下，考察夾帶劑甲醇-0.2% 磷酸、乙醇-0.2% 磷酸，以及不同夾帶劑流量對(duì)活性組分分離度的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示。

從圖 2 中可以看出，甲醇-0.2% 磷酸的分離效果優(yōu)于乙醇-0.2% 磷酸，在甲醇-0.2%磷酸體積流量大于4 mL·min-1時(shí)，兩組分的分離度R＞1.5；另外，隨著夾帶劑體積流量的增大，蘆丁與山奈酚-3-O-蕓香糖苷活性組分的分離度先增大后減小，即隨著夾帶劑在流動(dòng)相中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，流動(dòng)相對(duì)各個(gè)活性組分的洗脫能力也增大，但當(dāng)夾帶劑的體積流量達(dá)到一定值后，流動(dòng)相的洗脫能力過(guò)強(qiáng)，減弱了對(duì)各組分洗脫能力的差別，反而使活性組分的分離度降低。因此確定適宜的夾帶劑(甲醇-0.2 %磷酸)體積流量為 4.5 mL·min-1。

3.2 CO2 質(zhì)量流量的影響

CO2質(zhì)量流量變化會(huì)影響各組分在流動(dòng)相與固定相之間的分配，進(jìn)而影響組分的分離效果。圖3 為在溫度313.15 K、壓力12 MPa、夾帶劑體積流量4.5 mL·min-1及CO2質(zhì)量流量14～22 g·min-1的條件下，CO2質(zhì)量流量對(duì)苦蕎活性組分分離度的影響。

如圖3 所示，分離度隨著CO2質(zhì)量流量的增加先增大后減小，CO2質(zhì)量流量在18～20 g·min-1內(nèi)，分離度均大于1.5，達(dá)到分離效果?？紤]到CO2流量過(guò)大易導(dǎo)致色譜柱壓降過(guò)大，操作費(fèi)用增大，影響色譜柱的使用壽命。因此，在保證各活性組分能夠有效分離的前提下，選擇較低的CO2質(zhì)量流量，確定適宜的 CO2質(zhì)量流量為 18 g·min-1。

圖3 CO2 質(zhì)量流量對(duì)苦蕎活性組分分離度影響Fig.3 Effects of CO2 flow rate on separation resolution of tartary buckwheat active components

圖4 壓力對(duì)苦蕎活性組分分離度影響Fig.4 Effects of pressure on separation resolution of tartary buckwheat active components

3.3 壓力的影響

色譜操作壓力的變化會(huì)對(duì)流動(dòng)相密度產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響組分在流動(dòng)相及固相表面的分配[16]。本文考察了壓力對(duì)苦蕎活性組分分離度及保留因子的影響，實(shí)驗(yàn)條件：夾帶劑體積流量 4.5 mL·min-1、CO2質(zhì)量流量18 g·min-1、溫度308.15～323.15 K 及壓力8～16 MPa。圖4、5 分別為壓力對(duì)苦蕎活性組分分離度及保留因子的影響。

圖5 壓力對(duì)蘆丁及山奈酚-3-O-蕓香糖苷組分保留因子的影響Fig.5 Effects of pressure on the retention factors of rutin and kaempferol-3-O-rutinoside

從圖4 中可以看出，不同溫度下，分離度均隨著壓力的增高先增大后減小。一方面，壓力增加直接導(dǎo)致流動(dòng)相密度增加，溶劑化能力增強(qiáng)，由于流動(dòng)相對(duì)蘆丁及山奈酚-3-O-蕓香糖苷活性組分溶解能力的影響程度不同，使得分離度有所增加；另一方面，當(dāng)壓力增加至一定程度時(shí)，流動(dòng)相對(duì)各組分的溶解能力趨于相同，反而導(dǎo)致分離度降低。在壓力為14 MPa 時(shí)，山奈酚-3-O-蕓香糖苷與蘆丁組分的分離度達(dá)到最大，因此選擇14 MPa 作為適宜的操作壓力。

如圖5 所示，當(dāng)溫度保持恒定時(shí)，k1及k2均隨著壓力的升高而減小。壓力升高使流動(dòng)相的密度增加，增強(qiáng)溶質(zhì)組分在流動(dòng)相中的溶解度，溶質(zhì)分子在色譜柱中的保留時(shí)間減少，因而保留因子k1及k2減小。此外，由于在低壓區(qū)內(nèi)物質(zhì)密度對(duì)壓力的變化更加敏感，使得溶質(zhì)保留因子在低壓區(qū)內(nèi)受壓力的影響更加顯著。因此，在低壓區(qū)蘆丁及山奈酚-3-O-蕓香糖苷組分的保留因子隨著壓力的升高其降低程度比較顯著。

3.4 溫度的影響

色譜操作溫度的變化會(huì)引起流動(dòng)相密度的改變，從而影響各組分在流動(dòng)相與固定相表面的分配。本文進(jìn)一步研究了溫度對(duì)活性組分分離度及保留因子的影響，實(shí)驗(yàn)條件：夾帶劑流量 4.5 mL·min-1、CO2流量18 g·min-1、壓力8～16 MPa及溫度308.15～323.15 K，具體見(jiàn)圖6、7。

從圖6 中可以看出，在壓力一定時(shí)，分離度隨溫度的升高呈先增大后減小的趨勢(shì)，溫度升高一方面增強(qiáng)傳質(zhì)過(guò)程，使色譜峰寬減小；另一方面，溫度的升高使流動(dòng)相的密度降低，減弱了其對(duì)溶質(zhì)分子的束縛作用，使軸向擴(kuò)散效應(yīng)增強(qiáng)，造成色譜峰彌散程度增強(qiáng)[17]。在這2 種相反結(jié)果的共同作用下，導(dǎo)致分離度在溫度為318.15 K 時(shí)出現(xiàn)最大值，由此確定SFC 分離的適宜溫度為318.15 K。

如圖7 所示，當(dāng)壓力一定時(shí)，保留因子k1及k2均隨著溫度升高而增大。一方面，溫度升高，流動(dòng)相密度減小，使流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度降低，溶質(zhì)組分的保留時(shí)間增加[18]；另一方面，溫度的升高也會(huì)使溶質(zhì)組分蘆丁及山奈酚-3-O-蕓香糖苷的擴(kuò)散能力增強(qiáng)，在固定相上的吸附能力減弱，保留時(shí)間減??；在實(shí)驗(yàn)條件下，流動(dòng)相對(duì)活性組分的洗脫能力的影響程度大于流動(dòng)相對(duì)于溶質(zhì)組分?jǐn)U散行為的影響，因而隨著溫度的升高，兩組分在流動(dòng)相中的溶解分配量降低，即流動(dòng)相對(duì)組分的洗脫能力降低，保留因子k1及k2增大。

圖6 溫度對(duì)苦蕎活性組分分離度的影響Fig.6 Effects of temperature on retention factor of tartary buckwheat active components

圖7 溫度對(duì)蘆丁及山奈酚-3-O-蕓香糖苷組分保留因子的影響Fig.7 Effects of temperature on the retention factors of rutin and kaempferol-3-O-rutinoside

3.5 活性組分的產(chǎn)品制備

通過(guò) 3.1～3.4 節(jié)的實(shí)驗(yàn)研究，得到了 SFC 提純苦蕎活性組分的適宜工藝條件：CO2質(zhì)量流量18 g·min-1、夾帶劑體積流量4.5 mL·min-1、溫度318.15 K 及壓力14 MPa。對(duì)于蘆丁及山奈酚-3-O-蕓香糖活性組分產(chǎn)品制備過(guò)程，除滿足活性組分產(chǎn)品純度要求，還應(yīng)最大程度提高原料處理負(fù)荷。圖8 為不同的進(jìn)樣量下苦蕎活性組分的SFC 分離譜圖。

圖8 不同進(jìn)樣量下苦蕎活性組分的SFC 分離譜圖Fig.8 Chromatograms of tartary buckwheat active component by SFC separation at different volumes

由圖8 中可以得出，當(dāng)進(jìn)樣量由15、20 到25 μL 不斷增加，蘆丁及山奈酚-3-O-蕓香糖苷組分的色譜峰的響應(yīng)值逐漸增大，分離度不斷減小。當(dāng)進(jìn)樣量增大到20 μL 時(shí)，蘆丁與山奈酚-3-O-蕓香糖苷組分的色譜峰的基線分離達(dá)到臨界狀態(tài)，勉強(qiáng)實(shí)現(xiàn)兩組分色譜峰的基線分離，當(dāng)進(jìn)樣量繼續(xù)增大到25 μL 時(shí)，兩組分的色譜峰出現(xiàn)重合現(xiàn)象，不能完全分離；另外，對(duì)收集的活性組分產(chǎn)品進(jìn)行了純度分析，結(jié)果表明，當(dāng)進(jìn)樣量為20 μL時(shí)，蘆丁活性組分產(chǎn)品純度92.7%，山奈酚-3-O-蕓香糖苷活性組分產(chǎn)品純度90.71 %，兩活性組分產(chǎn)品純度均≥90%，而當(dāng)進(jìn)樣量增加到25 μL 時(shí)，活性組分產(chǎn)品純度＜90%，故確定活性組分的產(chǎn)品制備過(guò)程的適宜的最大進(jìn)樣量為20 μL。在以上適宜的工藝條件下，獲得的蘆丁活性組分產(chǎn)品純度為92.7 %，保留時(shí)間范圍4.3～5.3 min，收率60.14%；山奈酚-3-O-蕓香糖苷活性組分產(chǎn)品純度為90.71 %，保留時(shí)間范圍5.6～8.0 min，產(chǎn)品收率35.85%，滿足活性組分產(chǎn)品要求。

3.6 建立保留因子模型

保留因子是描述溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中分配特性的參數(shù)，常用的保留因子模型有平均晶格場(chǎng)模型、溶解度參數(shù)方程、統(tǒng)計(jì)熱力學(xué)點(diǎn)陣模型及van't Hoff 方程等，其中，MARTIRE 等[19]提出的平均晶格場(chǎng)模型，考慮了體系的膨脹性和壓縮性，能夠直接體現(xiàn)溫度及密度對(duì)溶質(zhì)保留因子的影響，較好地描述SFC分離過(guò)程中溶質(zhì)組分在液固兩相中的分配行為。因此，本文采用該模型對(duì) SFC 體系中蘆丁保留因子 k1及山奈酚-3-O-蕓香糖苷保留因子k2進(jìn)行模型擬合，建立相應(yīng)的保留因子模型，通過(guò)保留因子的計(jì)算值和實(shí)驗(yàn)值的相對(duì)平均誤差(relative average error, ARE)評(píng)價(jià)模型的擬合結(jié)果。平均晶格場(chǎng)模型的基本表達(dá)見(jiàn)式(3)：

式中：K 為分配系數(shù)，ln K0為固定相對(duì)保留過(guò)程的貢獻(xiàn)，K0為當(dāng)超臨界流體密度無(wú)限接近于0 時(shí)的分配系數(shù)。F(Tr,ρr)為超臨界流體對(duì)ln K 的貢獻(xiàn)，?為固定相在溶漲和外壓作用下對(duì)ln K 的修正項(xiàng)。?較小，在實(shí)際應(yīng)用中可以忽略。

K 與保留因子k 的關(guān)系式見(jiàn)式(4)：

將式(4)代入式(3)并整理，得到一個(gè)五參數(shù)的方程：

式中：Vm、Vs為流動(dòng)相和固定相的體積，mL；ρ 為 SC-CO2的密度，g·cm-3；T 為溫度，K。

在壓力8～16 MPa、溫度308.15～323.15 K 的條件下，計(jì)算超臨界流體的密度，將k1及k2與密度、溫度進(jìn)行關(guān)聯(lián)，得到模型方程如下：

采用式(6)及(7)的保留因子模型，對(duì) SFC 提純蘆丁及山奈酚-3-O-蕓香糖苷活性組分過(guò)程的保留因子進(jìn)行計(jì)算預(yù)測(cè)，兩組分保留因子的ARE 分別為2.56%及1.66%，說(shuō)明模型擬合計(jì)算結(jié)果良好。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)蘆丁和山奈酚-3-O-蕓香糖苷活性組分的超臨界流體工業(yè)色譜提純工藝的研究，得到主要結(jié)論如下：

(1) 獲得了夾帶劑、CO2質(zhì)量流量、壓力、溫度及進(jìn)樣量等超臨界工藝條件對(duì)苦蕎活性組分分離度及保留因子的影響規(guī)律，確定了采用SFC 提純蘆丁和山奈酚-3-O-蕓香糖苷活性組分產(chǎn)品的適宜工藝條件：CO2質(zhì)量流量18 g·min-1、夾帶劑(甲醇-0.2 %磷酸)體積流量4.5 mL·min-1、溫度318.15 K、壓力14 MPa及進(jìn)樣量20 μL，對(duì)應(yīng)的蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷活性組分的純度分別為92.7%、90.71%，滿足兩活性組分產(chǎn)品要求；

(2) 在壓力8～16 MPa，溫度308.15～323.15 K 的超臨界工藝條件下，蘆丁和山奈酚-3-O-蕓香糖苷活性組分的保留因子隨著溫度的升高而增加，隨著壓力的升高而下降；

(3) 采用簡(jiǎn)化平均晶格場(chǎng)模型，分別建立了蘆丁及山奈酚-3-O-蕓香糖苷活性組分的保留因子模型：

得到的2 組分保留因子的計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)值的ARE 分別為2.56%、1.66%，說(shuō)明模型擬合計(jì)算結(jié)果良好。