莫 迪,李夢雨，李華洋，王志龍，李麗娟，金 紅

(牡丹江醫(yī)學院1.第一臨床醫(yī)學院；2.附屬紅旗醫(yī)院檢驗科；3.附屬紅旗醫(yī)院質控科；4.研究生處；5.附屬紅旗醫(yī)院病理科，黑龍江 牡丹江 157011)

膽管癌是在癌癥患者中仍然被認為是一種罕見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率大約為1%[1]。膽管癌輔助診斷的實驗室常規(guī)檢測指標為傳統(tǒng)的腫瘤標志物(包括CA199和CEA等)，但是單獨檢測的診斷敏感性和特異性較低。而現(xiàn)在液體活檢技術正在迅速發(fā)展并廣泛應用于臨床，是一種通過檢測患者的血液、腦脊液、尿液、胸膜腔液和腹水等液體中的生物標志物的檢驗手段。其中血液標志物包括：cfDNA、循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)、循環(huán)腫瘤細胞(Circulating tumor cells,CTCs)、外泌體(exosomes)等[3]。其中cfDNA被稱作循環(huán)游離DNA，是指由正常細胞凋亡或腫瘤細胞壞死而釋放入體循環(huán)中的游離DNA。通常腫瘤患者血漿的cfDNA水平要遠高于正常人，人們通過定量檢測血漿的cfDNA判斷患者是否存在腫瘤。與傳統(tǒng)腫瘤標志物相比較，這些血液標志物對多種癌癥的早期診斷具有較高的診斷效能，可以實時的動態(tài)監(jiān)測癌癥患者的治療效果和預后情況等。

由于單一的腫瘤標志物對膽管癌的診斷尚缺乏足夠高的敏感性和特異性，因此，我們聯(lián)合檢測血液中的與膽管癌相關的腫瘤標志物糖類抗原(CA199)、癌胚抗原(CEA)和血漿游離(cfDNA)的水平，旨在探討其是否提高膽管癌的診斷效率。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 納入標準 膽管癌組和良性膽管疾病組：(1)根據主要臨床癥狀有腹部不適、脹痛、乏力、上腹腫塊、黃疸、發(fā)熱和消瘦，血液檢驗肝功指標異常，影像學檢查證實膽管存在病變者，包括膽管腫瘤、膽管結石、膽管囊腫等；(2)膽管癌患者術前未接受任何化療、放療及生物治療等；(3)經過手術或超聲介導的細針穿刺病理檢查診斷為膽管癌和良性膽管疾病。健康人組為與膽管癌組和良性膽管疾病組為同時期健康體檢者。

1.1.2 排除標準 (1)全身其他系統(tǒng)或器官良、惡性腫瘤；(2)存在嚴重的心臟、肝臟、腎臟等功能問題；(3)由其他惡性腫瘤轉移的膽管癌患者；(4)經手術病例未證實為原發(fā)性膽管癌；(5)術前接受過放療或化療,近期接受免疫抑制治療等；(6)全身情況差不耐受手術者；(7)有嚴重的凝血功能障礙和出血風險的患者；(8)合并其他嚴重的肝膽消化系統(tǒng)疾病，如肝硬化，胰腺炎等；

1.1.3 一般資料 根據納入和排除標準，收集2018年1月至2019年8月間哈醫(yī)大附屬腫瘤醫(yī)院及牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院的85名膽管疾病患者。按病理結果分組，膽管癌組共45例，男29例，女16例，平均年齡為(63.4±15.2)歲，均為腺癌，其中高分化者共3例，中分化者31例，低分化者11例；良性膽管疾病組40例患者，男性22例，女性18例，包括膽管結石29例，膽管囊腫11例，平均年齡為(59.3±13.6)歲。健康人組45人，男性23例，女性22例，平均年齡為(58.2±14.3)歲。三組性別、年齡分布無統(tǒng)計學差異。本研究嚴格按照赫爾辛基宣言,經醫(yī)學倫理委員會批準，所有納入研究的人員均自愿簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器全自動微粒子化學發(fā)光儀(i2000)購于美國雅培公司，實時熒光定量PCR儀(ViiATM 7 Real-Time PCR System)購于美國ABI公司，糖類抗原199定量測定試劑盒(化學發(fā)光微粒子免疫分析法)和癌胚抗原定量測定試劑盒(化學發(fā)光微粒子免疫分析法)購于美國雅培公司，血清/血漿游離DNA(cfDNA)提取試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，人GAPDH引物基因購于上海生工生物工程股份有限公司，人類基因組DNA購于美國Promega公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 血液標本采集與前處理 采集患者清晨空腹的肘靜脈血，獲得血清及血漿。

1.3.2 CA199和CEA的檢測 使用全自動微粒子化學發(fā)光儀(美國雅培i2000)進行定量檢測三組人群的測待樣本血清的CA199和CEA水平。

1.3.3 cfDNA的檢測 采用實時熒光定量PCR定量檢測cfDNA水平。使用血清/血漿游離DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取血漿中的cfDNA，儲存在-20℃冰箱。使用針對cfDNA上穩(wěn)定存在的管家基因GAPDH基因為引物(上海生工生物工程股份有限公司)，人類基因組DNA作為標準品，按1∶10、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800進行梯度稀釋制作標準曲線。提取的DNA樣本一次凍融后，使用實時熒光定量PCR儀進行擴增反應，反應條件設置如下：95℃3min、95℃3s、60℃30s，共40個循環(huán)。反應完成后，根據得到的Ct值，帶入標準曲線，計算出相應的DNA含量。

1.4 統(tǒng)計學方法使用SPSS 16軟件處理與分析數據。采用K-S法進行正態(tài)性檢驗，符合非正態(tài)性分布的計量資料使用中位數(M)和四分位間距(P25，P75)表示，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗比較。計數資料以頻數和百分比(n，%)表示，使用卡方檢驗進行組間比較。繪制單獨檢測三種血液標志物的ROC曲線，二元Logistic回歸方程計算出三種血液標志物聯(lián)合檢測的概率值，繪制聯(lián)合檢測的ROC曲線，AUC組間差異的比較使用Z檢驗，計算約登指數確定cfDNA的cut-off值。以P<0.05被視為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組的CA199、CEA及cfDNA表達水平的比較膽管癌組患者血清CA199和cfDNA水平均明顯高于良性膽管疾病組和正常對照組，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。而膽管癌組CEA水平與良性膽管疾病組和正常對照組相比較，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。詳見表1。

表1 三組血液標志物濃度及比較[M(P25，P75)]

2.2 單獨檢測和聯(lián)合檢測的ROC曲線聯(lián)合檢測CA199、CEA和cfDNA對膽管癌診斷的敏感性和特異性高于單獨檢測，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。三項指標聯(lián)合檢測的AUC最大，AUC為0.903。通過計算約登指數得出cfDNA的cut-off值為18.06ng/mL。詳見圖1、表2。

圖1 三種血液標志物單獨檢測和聯(lián)合檢測的ROC曲線

表2 三種標志物單獨檢測和聯(lián)合檢測診斷膽管癌的敏感性和特異性(%)、AUC

2.3 患病組血液標志物的陽性數和陽性率的比較按照CA199和CEA已知的參考值和經過ROC曲線計算出的cfDNA的cut-off值，膽管癌組和良性膽管疾病組各組的陽性數和陽性率如表3。膽管癌組與良性膽管疾病組相比較CA199、CEA和cfDNA的陽性數和陽性率均明顯升高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表3 兩組的CA199、CEA和cfDNA的陽性數和陽性率[n(%)]

3 討論

CA199是一種糖蛋白抗原，是目前公認的膽管癌最為有效的診斷和檢測預后的腫瘤標志物[4]。已有研究表明膽管癌術前CA199高水平是獨立預后不良因素[5]，并且對于診斷膽管癌的靈敏性也有較高水品。CEA是一種蛋白質類腫瘤標志物，由于器官定位較差，好發(fā)于不同部位的腫瘤患者血清CEA均有不同程度的增高[6]。并且有研究表明膽管癌細胞可以產生CEA，單獨檢測血清中的CEA的診斷靈敏性和特異性均不高[7]，臨床中CA199和CEA已被廣泛應用于胰腺癌、膽管癌及其他消化系統(tǒng)腫瘤的診斷和監(jiān)測療效和預后。因此，要和其他腫瘤標志物聯(lián)合檢測來提高對膽管癌的診斷效率。cfDNA被稱為是循環(huán)游離DNA，是一種存在于體液中的游離DNA[8]。我們的研究中主要是研究了在血漿中存在的血漿游離DNA含量。血漿游離DNA(cfDNA)是一種由于細胞凋亡、壞死和/或被巨噬細胞消化而釋放入血液的游離DNA[9]。這種利用檢測癌癥患者血漿中的cfDNA作為惡性腫瘤的診斷、檢查治療效果和判斷預后的手段被稱為液體活檢[10]。液體活檢被認為是一種無創(chuàng)且對于腫瘤的早期診斷有很高的靈敏性和特異性的檢測手段。并且大量研究表明，惡性腫瘤患者,如肺癌、結直腸癌和乳腺癌等患者的血漿cfDNA含量均明顯高于健康人[11-13]。但是在膽管癌中鮮有探討，本研究檢測了膽管癌患者血漿中的cfDNA，計算其單獨檢測的診斷靈敏性和特異性，并且評價了CA199、CEA和cfNDA聯(lián)合檢測是否提高了診斷敏感性和特異性。

本研究結果表明，膽管癌組分別與良性膽管疾病組及健康人對照組相比較CA199和cfDNA水平均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而膽管癌組的CEA水平和良性膽管疾病組和正常對照組相比有升高，但差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。蘇德望[14]等報道，檢測74例膽管癌患者血清CA199和CEA的水平均明顯高于良性膽管疾病組(60例)和健康人組(60例)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與本研究的結果不一致，可能是由于研究的膽管癌患者不同總體間的差異，收集的膽管癌患者的CEA低水平較多，中位數和四分位間距與良性組和對照組相差不多，可以通過提高樣本量再做統(tǒng)計分析。以膽管癌組和良性膽管疾病組為研究對象繪制了三種腫瘤標志物單獨和聯(lián)合檢測的ROC曲線，得到了3種腫瘤標志物的診斷膽管癌的靈敏性、特異性和AUC，從本研究結果顯示，CA199單獨檢測時對膽管癌的診斷靈敏性最高，為84.4%，AUC為0.864；CEA單獨檢測時的診斷靈敏性和特異性均不是很高，為51.1%和77.5%，AUC為0.661；cfDNA單獨檢測的靈敏性不是很高，但是它的診斷特異性很高，為95.0%，AUC為0.759。通過Logistic回歸建立三種標志物聯(lián)合診斷的回歸模型，通過模型算出的概率值來繪制ROC曲線，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測的敏感性和AUC均高于各腫瘤標志物單獨檢測的值，特異性除了低于cfDNA的單獨檢測結果，均高于單獨檢測CA199和CEA的特異性結果。但是有研究者發(fā)現(xiàn)，膽管癌患者膽汁中的CA199和CEA聯(lián)合檢測也可以提高診斷效率，并且檢測膽汁中的CA199和CEA水平對膽管癌的診斷優(yōu)于檢測血清中的這兩項指標[15]。

綜上所述，膽管癌患者的血清CA199、CEA和血漿cfDNA均呈較高水平，聯(lián)合檢測這三種腫瘤標志物也具有較高的診斷敏感性和特異性，為診斷膽管癌提供重要的參考。