陰 迪,王一涵,王奕丹,黃鈺雯,劉麗梅

0 引 言

肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移都與腫瘤微環(huán)境密切相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)核酸的細(xì)微改變來(lái)影響腫瘤微環(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤形成與發(fā)展[1-2]。已有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展與組蛋白乙?；揎棧鞣NDNA的甲基化情況都有相關(guān)性。外泌體是細(xì)胞分泌的30～100 nm的微小囊泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含蛋白成分與核酸成分，已有研究表明，外泌體會(huì)參與細(xì)胞通訊，是細(xì)胞間溝通的重要媒介[3-5]。結(jié)合兩者對(duì)腫瘤影響的相關(guān)性，我們推測(cè)腫瘤自身外泌體會(huì)影響于腫瘤細(xì)胞自身的甲基化程度從面調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)，為進(jìn)一步驗(yàn)證推測(cè)，我們從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和核酸分析等多角度，檢測(cè)了肝癌細(xì)胞HepG2外泌體對(duì)其自身生長(zhǎng)情況和DNA甲基化程度及相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器HepG2肝癌細(xì)胞(上海中科院細(xì)胞庫(kù))，DMEM(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，CD63抗體(abcam,ab193349)，CD9抗體(abcam,ab92726)，超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物(Boster)，DiI紅色熒光探針(Beyotime)，熒光一抗5MC-CD FITC(abcam,ab179898)，RNA提取與反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)，SYBR(Takara)，熒光定量PCR儀(Thermo)，透射電子顯微鏡(Hitachi)，納米粒度分析儀(Microtrac)，垂直板電泳系統(tǒng)(BIO-RAD)，超速離心機(jī)(Thermo)，熒光倒置顯微鏡(Nicon)。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將肝癌HepG2細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)，加入10%的胎牛血清和1%的青霉素鏈霉素混合雙抗，培養(yǎng)環(huán)境為5% CO2，37 ℃，濕度飽和的細(xì)胞培養(yǎng)箱，隔天胰酶消化后傳代。

1.2.2外泌體的提取外泌體提取之前，將生長(zhǎng)至50%～60%的細(xì)胞培養(yǎng)液換成無(wú)血清的DMEM處理48h，收集上清，用0.22 μm濾器(Millipore)過(guò)濾后進(jìn)行差速離心提取[6]，所有離心均在4 ℃進(jìn)行，過(guò)程如下：將收集好的細(xì)胞上清液3000 r/min離心30 min，棄沉淀，將上清液轉(zhuǎn)移至PC管中，35 000 r/min離心90 min，棄上清，加1 mL PBS沖洗內(nèi)壁沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5 mL Ep管中，渦旋振蕩15 min分散后，10 000 r/min離心30 min，棄沉淀，將上清液轉(zhuǎn)移至超離管，35 000 r/min離心2 h，棄上清，加90 μL PBS混勻。

1.2.3外泌體的鑒定透射電鏡拍照，將樣品置于銅網(wǎng)上，3%磷鎢酸溶液20 μL負(fù)染5 min后濾紙吸干，置于透射電鏡樣品室內(nèi)觀察形態(tài)并拍照。粒徑檢測(cè)，先用高壓過(guò)的PBS將參數(shù)調(diào)零，擦干后加200 μL的外泌體懸液到樣品室內(nèi)，設(shè)置90 s，3次平行檢測(cè)液體中粒徑大小。Western blot檢測(cè)CD63和CD9兩種蛋白，選擇10%的分離膠和4%的濃縮膠制備SDS-PAGE；RIPA裂解外泌體蛋白，另裂解一盤(pán)細(xì)胞總蛋白做陽(yáng)性對(duì)照。將兩組樣品與4×loading buffer混合，95 ℃煮樣15 min，冷卻后上樣30 μg，在濃縮膠中80 V電泳，進(jìn)入分離膠后調(diào)整為100 V，跑到底部即可停止。半干轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)膜，陽(yáng)極到陰極的放置順序?yàn)椋汉駷V紙、PVDF膜、膠、厚濾紙，25 V轉(zhuǎn)膜15 min；轉(zhuǎn)膜后把膜放在5%脫脂奶中室溫?fù)u床封閉3 h，取出后置于1∶1000的一抗4 ℃搖床過(guò)夜，5%脫脂奶搖床洗30 min，3次；上1∶4000的二抗室溫?fù)u床1 h，5%脫脂奶搖床洗1次5 min，PBS-T搖床洗2次，每次5 min，PBS搖床洗2次，每次5 min。按說(shuō)明書(shū)配制發(fā)光底物，加入作用底物后用成像系統(tǒng)成像顯影。

1.2.4腫瘤細(xì)胞對(duì)自身外泌體的攝取制備細(xì)胞爬片備用，將無(wú)菌清潔的小玻片(1 cm×1 cm)放于24孔板中，計(jì)數(shù)3×104個(gè)細(xì)胞種進(jìn)24孔板培養(yǎng)至貼壁。用DiI染料按說(shuō)明書(shū)標(biāo)記外泌體用PBS洗2遍后[6]，超高速離心濃縮外泌體。用DMEM將沉淀重懸備用。對(duì)照組加入100 μL PBS處理，實(shí)驗(yàn)組加入100 μL混有標(biāo)記好外泌體的DMEM(0.5 mg/mL)處理。為排除非特異性染色，將最后一遍清洗的PBS上清取100 μL加入第3孔，培養(yǎng)箱孵育12 h后將24孔板取出，用熒光染核劑Hoechst33258標(biāo)記細(xì)胞核，用多聚甲醛避光固定細(xì)胞20 min，PBS洗2遍。DABCO封固，倒置熒光顯微鏡觀察。紅色熒光即為DiI標(biāo)記在膜結(jié)構(gòu)上的信號(hào)，藍(lán)色熒光即為Hoechst33258標(biāo)記的細(xì)胞核，合成圖片如果紅色熒光的外泌體進(jìn)入了細(xì)胞內(nèi)，即表明DiI進(jìn)入了細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。在最后洗滌的PBS平行實(shí)驗(yàn)中，若沒(méi)有發(fā)現(xiàn)紅色熒光信號(hào)，說(shuō)明沒(méi)有非特異性熒光染色。

1.2.5劃痕實(shí)驗(yàn)在24孔板中每孔接種1×104個(gè)HepG2細(xì)胞，待長(zhǎng)滿后，棄上清，用普通標(biāo)準(zhǔn)黃槍頭進(jìn)行劃痕，保持槍頭垂直，保證各孔劃痕基本一致；用PBS清洗去脫落的細(xì)胞和漂浮在孔內(nèi)的細(xì)胞碎片；向各孔中加入無(wú)血清的饑餓培養(yǎng)基。對(duì)照組加入100 μLPBS處理，實(shí)驗(yàn)組加入100 μL的外泌體懸液(0.5 mg/mL)處理，放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)；取時(shí)間點(diǎn)6 h，12 h觀察細(xì)胞分布狀態(tài)并進(jìn)行鏡下拍照；計(jì)算劃痕面積占圖片面積的比例來(lái)計(jì)算細(xì)胞的增殖率，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.6免疫熒光染色將無(wú)菌蓋玻片裁成1 cm×1 cm方塊放進(jìn)24孔板中，每孔接種5×104細(xì)胞，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后觀察，覆蓋率在50%時(shí)，對(duì)照組加入100 μLPBS處理，實(shí)驗(yàn)組加入100 μLPBS溶好的Exos懸液(0.5 mg/mL)處理，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入4%多聚甲醛對(duì)細(xì)胞避光固定20 min，將玻片取出放進(jìn)小皿中，用PBS洗2遍，每次5 min。加入0.2%的TritonX-100透化40 min，吸出液體，加入4N鹽酸酸化30 min，再用pH8.0的Tris-HCL中和20 min。用PBS洗3次，每次5 min。加入1%的BSA溶液4 ℃封固過(guò)夜。PBS洗凈后，用100 μL的1∶50的熒光抗體5MC-CD(FITC)滴加在玻片上，4 ℃避光過(guò)夜。次日將抗體吸出，PBS搖床洗3次，每次30 min。用Hoechst33258染色液(5 mg/L)避光染核10 min。PBS洗凈，DABCO封固，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。拍照結(jié)果中綠色熒光更強(qiáng)的組別甲基化程度更強(qiáng)。

1.2.7引物設(shè)計(jì)、合成與熒光定量分析選定3個(gè)與甲基化相關(guān)的基因DNMT3A、DNMT3B、DNMT1和凋亡相關(guān)基因Bax、BcI-2進(jìn)行檢測(cè)。待傳的細(xì)胞貼壁后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞使用100 μL的0.5 μg/mL外泌體處理，對(duì)照組細(xì)胞使用100 μL的PBS處理，培養(yǎng)24 h至長(zhǎng)滿。提取兩組細(xì)胞的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，體系為20 μL，其中上下游引物各0.4 μL，cDNA模板0.4 μL，去離子水8.8 μL，SYBR Premix ExTaqⅡ10 μL。華大公司合成引物。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s；共40個(gè)循環(huán)。60 ℃-95 ℃繪制熔解曲線。內(nèi)參為β-actin，用2-△△CT法對(duì)各基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。其中β-actin基因的上下游引物分別為3′-GATGAGATTGGCATGGCTTT,5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT;DNMT3B基因上下游引物分別為3′-CCCATTCGAGTCCTGTCATT,5′-GGTTCCAACAGCAATGGACT; DNMT1基因上下游引物分別為3′-ATGCTTACAACCGGGAAGTG,5′-TGAACGCTTAGCCTCTCCA;Bcl-2基因的上下游引物分別為3′-TCCTCTTTACACTGGCCAGG,5′-GAGTATTTGTGCAGCGAGGG;Bax基因的上下游引物分別為3′-CATCATGGGCTGGACATTGG,5′-CCTCAGCCCATCTTCTTCCA.

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1外泌體鑒定結(jié)果透射電鏡觀察外泌體可見(jiàn)圓形中間凹陷的膜狀結(jié)構(gòu)，粒徑大小30～100 nm，見(jiàn)圖1。Western blot成像后顯示CD63和CD9均有條帶出現(xiàn)，見(jiàn)圖2。

圖 1 透射電鏡觀外泌體

1:外泌體蛋白； 2：細(xì)胞總蛋白

2.2HepG2細(xì)胞對(duì)熒光標(biāo)記自身外泌體的攝取倒置熒光顯微鏡下可見(jiàn)紅色熒光的外泌體進(jìn)入了細(xì)胞內(nèi)，圍繞于藍(lán)色熒光的細(xì)胞核周圍或細(xì)胞核上，表明DiI進(jìn)入了細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。見(jiàn)圖3。

圖 3 肝癌細(xì)胞對(duì)自身外泌體攝取情況

2.3劃痕實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組6 h及12 h面積占比均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表 1 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果遷移率計(jì)算

2.4甲基轉(zhuǎn)移酶熒光抗體染色倒置熒光顯微鏡下拍照顯示，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞核內(nèi)綠色熒光要明顯強(qiáng)于對(duì)照組，見(jiàn)圖4。

圖 4 甲基化程度染色結(jié)果( ×40)

2.5腫瘤自身外泌體對(duì)腫瘤細(xì)胞甲基化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響實(shí)驗(yàn)組Bax、DNMT3A、DNMT3B基因表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)；而B(niǎo)cI-2表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

與對(duì)照組相比,*P<0.05

3 討 論

外泌體是細(xì)胞生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌出來(lái)的一類包含蛋白成分、核酸成分的有膜囊泡狀結(jié)構(gòu)。研究表明外泌體能夠作用于靶細(xì)胞，通過(guò)其內(nèi)容物來(lái)調(diào)控靶細(xì)胞的生理狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的外泌體進(jìn)行了提取鑒定，檢測(cè)了腫瘤細(xì)胞對(duì)自身外泌體的攝取和吸收，還有其攝取外泌體后的細(xì)胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞自身外泌體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。我們對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行了甲基化染色，熒光顯微鏡下結(jié)果清晰地顯示，實(shí)驗(yàn)組的甲基化程度明顯升高。我們嘗試從分子生物學(xué)角度對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行分析，通過(guò)對(duì)Bax、BcI-2兩組凋亡基因和DNMT3A、DNMT3B、DNMT1這幾個(gè)甲基化基因進(jìn)行定量分析，我們發(fā)現(xiàn)Bax基因表達(dá)量升高，Bcl-2的表達(dá)量降低，有研究表明，Bcl-2/Bax的比例是細(xì)胞凋亡啟動(dòng)過(guò)程中開(kāi)關(guān)一樣的存在，二者是通過(guò)形成二聚體的方式來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的: 當(dāng)Bax與Bax之間形成同源二聚體時(shí)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡; 而當(dāng)Bax與Bcl-2之間形成異源二聚體時(shí)就會(huì)抑制細(xì)胞凋亡[7]。結(jié)合我們的檢測(cè)結(jié)果可以看出，實(shí)驗(yàn)組的Bax增多伴隨Bcl-2銳減，說(shuō)明大量的Bcl-2已經(jīng)與Bax生成了異源二聚體，而過(guò)量的Bax之間并沒(méi)有形成大量同源二聚體。結(jié)合二者的比例，我們可以推斷出腫瘤細(xì)胞的外泌體是通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡的方式，來(lái)增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖遷移能力，所以實(shí)驗(yàn)組的凋亡會(huì)減低。

我們發(fā)現(xiàn)外泌體對(duì)DNMT1這類持續(xù)性甲基轉(zhuǎn)移酶基因的轉(zhuǎn)錄量的影響較小，外泌體更有可能是通過(guò)提高DNMT3A、DNMT3B這類從頭甲基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)錄量的方式來(lái)調(diào)高腫瘤細(xì)胞的甲基化水平，從而調(diào)低細(xì)胞凋亡促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[8-10]。大量研究表明，腫瘤的病程進(jìn)展與miRNA密切相關(guān)。其中與肝癌相關(guān)的miRNA-23，miRNA-139，miRNA-34a等，都會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的周期和凋亡情況[11]。其中miRNA-23和miRNA-139作為肝癌細(xì)胞特有的小RNA極有可能被外泌體包裹，來(lái)完成細(xì)胞間的信息傳遞，而且已經(jīng)被證實(shí)參與調(diào)控細(xì)胞凋亡[12]。在許多腫瘤外泌體中已經(jīng)檢測(cè)到miRNA-34a的存在，并且影響細(xì)胞的增殖能力[13]。這些小RNA極有可能以外泌體為載體靶向運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)，來(lái)達(dá)到調(diào)控凋亡基因轉(zhuǎn)錄的作用。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，更可能是這類小RNA改變了從頭甲基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)量進(jìn)而引起了凋亡基因表達(dá)量的改變。這種多基因的調(diào)控通?；ハ嘤绊?，十分復(fù)雜，需要進(jìn)一步確定這些基因?qū)τ谀[瘤細(xì)胞DNA甲基化的生物學(xué)作用，從而為腫瘤的控制提供更多的指導(dǎo)。

綜上所述，腫瘤自身外泌體可以在體外通過(guò)提升DNMT3A、DNMT3B基因的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)調(diào)控腫瘤細(xì)胞甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)量，甲基化程度影響B(tài)ax基因轉(zhuǎn)錄量從而抑制BcI-2的表達(dá)量，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡并促進(jìn)增殖能力?？傮w來(lái)看，0.5μg/mL的腫瘤自身外泌體對(duì)腫瘤細(xì)胞的DNA甲基化有促進(jìn)作用。盡管腫瘤自身外泌體在體外可以影響其表觀遺傳修飾狀態(tài)，在以后的實(shí)驗(yàn)中我們也還需要進(jìn)一步明確其所含的成分及濃度對(duì)細(xì)胞DNA甲基化的影響，從而為肝癌的臨床靶向治療提供參考。