楊美娟，虞天一，喬東艷，張建瓊，于 紅

0 引 言

子癇前期指妊娠20周后孕婦新發(fā)高血壓和蛋白尿的一種系統(tǒng)性疾病，發(fā)病率為2%～8%，嚴(yán)重危害母兒健康[1]。研究表明，胎盤因素在子癇前期的發(fā)病中占重要地位，發(fā)病機制傾向于胎盤血管重塑障礙引發(fā)的胎盤源性疾病[2]。胚胎在4細胞時期開始建立極性，形成具有上皮樣極性的滋養(yǎng)外胚層以及被滋養(yǎng)外胚層包裹的內(nèi)細胞團[3]，其中，絨毛外滋養(yǎng)細胞是由胚胎外滋養(yǎng)層中細胞滋養(yǎng)細胞分化發(fā)育而來，具有增殖與侵襲能力，對母體子宮內(nèi)膜的黏附及侵入是胎盤形成的前提，向子宮內(nèi)膜局部侵襲，參與胎盤血管重塑。

細胞焦亡是不同于細胞凋亡和壞死的一種由GSDMD(gasdermin D)分子介導(dǎo)的程序性細胞死亡，光鏡下可見細胞腫脹、碎裂及質(zhì)膜氣泡形成等典型改變[4]。經(jīng)典途徑的激活包括2個中心環(huán)節(jié)：炎性小體的激活及GSDMD分子穿孔活性的釋放。NLRP3炎性小體是氧敏感性炎性小體，過氧化氫(H2O2)是一種很強的氧化劑，誘導(dǎo)機體氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，ROS激活核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白 3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3)炎性小體，進一步參與細胞焦亡通路的激活[5]。 NLRP3炎性小體的激活需要“啟動”和“激活”2個信號通路[6]。細胞焦亡是機體先天免疫的重要機制，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如心血管系統(tǒng)疾病動脈粥樣硬化[7]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病阿爾茲海默病[8]、呼吸系統(tǒng)急性損傷[9]等，且發(fā)揮重要作用。已有研究表明，NLRP3炎性小體及焦亡通路的激活與子癇前期發(fā)病具有相關(guān)性[10-11]。且本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，早發(fā)型子癇前期組孕婦血清中IL-1β的表達量明顯升高[12]。因此，本研究旨在構(gòu)建H2O2誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞焦亡模型， 體外模擬氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞發(fā)生焦亡損傷的病生理過程，為后續(xù)相關(guān)實驗提供一定的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與抗體人滋養(yǎng)細胞HTR-8/SVneo購買于北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司，1640培養(yǎng)基及胎牛血清購買于美國Gibco公司，Trizol購買于美國Sigma公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR qPCR Master Mix購買于南京諾唯贊生物科技有限公司，caspase-1、cleaved caspase-1抗體購買于美國Abcam公司，GSDMD抗體、IL-1β抗體購買于美國Santa Cruz，GAPDH抗體購買于南京迅貝公司，蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay kit)購買于美國Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞總蛋白提取及蛋白印跡實驗人滋養(yǎng)細胞HTR-8/SVneo培養(yǎng)于1640+10%胎牛血清+1%抗生素中。5% CO2及37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24小時換液1次。取對數(shù)生長期細胞，2.5×105個接種于6 cm的培養(yǎng)皿里，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，給予H2O2(100、150、200、250 μmol/L)處理細胞(2、4、6、12 h)，誘導(dǎo)人滋養(yǎng)細胞HTR-8/SVneo焦亡模型；對照為1640+10%胎牛血清+1%抗生素正常培養(yǎng)細胞。提取細胞總蛋白，按照BCA試劑盒使用說明操作，測定待測樣本蛋白質(zhì)濃度。將待測蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉常溫封閉2 h。加入一抗(稀釋倍數(shù)嚴(yán)格按照說明書)后置于4 ℃冰箱過夜，棄一抗，1×TBST溶液清洗，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶10 000)，室溫1 h，1×TBST溶液清洗，依次進行曝光、顯影、定影處理。

1.2.2RT-qPCR檢測細胞中mRNA水平按TRizol方法提取細胞中總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，按照SYBR試劑盒進行PCR擴增，每份樣品均做3個復(fù)孔，重復(fù)3次。相關(guān)引物如下，NLRP3：Forward primer (5′-3′) GAGGAAAAGGAAGGCCGACA，Reverse primer (5′-3′) TGGCTGTTCACCAATCCATGA；Caspase-1：Forward primer (5′-3′) TTTCCGCAAGGTTCGATTTTCA，Reverse primer (5′-3′) GGCATCTGCGCTCTACCATC；IL-1β：Forward primer (5′-3′) AGCTACGAATCTCCGACCAC，Reverse primer (5′-3′) CGTTATCCCATGTGTCGAAGAA；IL-18：Forward primer (5′-3′) ACTGTAGAGATAATGCACCCCG，Reverse primer (5′-3′) AGTTACAGCCATACCTCTAGGC；GSDMD：Forward primer (5′-3′) GAGTGTGGCCTAGAGCTGG，Reverse primer (5′-3′) GGCTCAGTCCTGATAGCAGTG；GAPDH：Forward primer (5′-3′) CGTGGAAGGACTCATGACCA，Reverse primer (5′-3′) GGCAGGGATGATGTTCTGGA。

1.2.3 倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)改變對數(shù)生長期細胞，以2.5×105個接種于6 cm的培養(yǎng)皿里，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，給予H2O2處理，設(shè)立對照(正常培養(yǎng)細胞)，倒置顯微鏡下，以倍數(shù)(×20)觀察細胞形態(tài)改變并拍照。

2 結(jié) 果

2.1 H2O2誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞焦亡模型的最佳濃度當(dāng)H2O2濃度為150 μmol/L時，作用于滋養(yǎng)細胞(2、4、6、12 h)，caspase-1的蛋白水平較對照明顯升高，且可檢測出相應(yīng)的剪切片段Cleaved caspase1；隨著H2O2濃度的增加，細胞焦亡經(jīng)典通路中關(guān)鍵分子切割片段Cleaved caspase-1的蛋白水平的表達被抑制，見圖1。上述結(jié)果提示，H2O2誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞焦亡模型的最佳濃度為150 μmol/L。

1-4：分別為100、150、200、250 μmol/L；5：control

2.2 H2O2誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞焦亡模型的最適時間當(dāng)H2O2為150 μmol/L，處理滋養(yǎng)細胞4h時，焦亡相關(guān)分子NLRP3、caspase1、切割片段Cleaved caspase1、GSDMD及IL-1β的蛋白水平明顯高于對照，且隨著作用時間的延長，蛋白質(zhì)表達水平被抑制，見圖2。結(jié)果提示H2O2誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞焦亡模型的最佳作用時間為4 h。

1：對照；2-5:分別為150 μmol/L H2O2作用2、4、6、12 h

2.3 H2O2誘導(dǎo)NLRP3炎性小體活化的“啟動”和“激活”信號當(dāng)H2O2為150 μmol/L，作用時間為2 h時，細胞焦亡經(jīng)典通路中上游關(guān)鍵部分NLRP3炎性小體“ 啟動” 信號相關(guān)分子NLRP3及IL-1β的mRNA水平較對照明顯上調(diào)(P<0.0001)，同時，NLRP3炎性小體“ 激活” 信號刺激下，細胞焦亡經(jīng)典通路中上游關(guān)鍵分子caspase1 的mRNA水平亦較對照組明顯升高(P<0.0001)；4 h時，細胞焦亡經(jīng)典通路中的關(guān)鍵分子GSDMD的mRNA水平及下游炎癥因子IL-18的mRNA 水平明顯高于對照組(P<0.05)。通過焦亡相關(guān)分子mRNA水平的逆向驗證，H2O2誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞焦亡模型最佳條件是150 μmol/L和4 h，見圖3。

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.4 滋養(yǎng)細胞系HTR-8/SVneo焦亡模型的典型形態(tài)學(xué)改變光鏡下可明顯觀察到，滋養(yǎng)細胞呈多邊形，緊密排列、邊界清晰可見，核漿比例明顯。設(shè)置H2O2濃度為150 μmol/L，作用于滋養(yǎng)細胞HTR-8/SVneo 4 h，光鏡下可明顯看到細胞腫脹、碎裂及質(zhì)膜氣泡形成等細胞焦亡典型改變。另外，隨著H2O2濃度的增加及作用時間的延長，幾乎所有的滋養(yǎng)細胞出現(xiàn)質(zhì)膜氣泡并聚集在一起呈“葡萄狀”。見圖4。

a:對照； b-d：150 μmol/L 4 h時紅框部分分別出現(xiàn)細胞腫脹、破碎、質(zhì)膜氣泡； e:250 μmol/L 12 h時細胞呈“葡萄狀”

3 討 論

子癇前期發(fā)病機制的兩階段學(xué)說：第 1 階段為病理生理變化形成過程，滋養(yǎng)細胞侵襲不足引起妊娠早期母體子宮螺旋動脈重塑障礙，胎盤灌注不足、缺血缺氧，發(fā)生氧化應(yīng)激，釋放多種胎盤因子，參與子癇前期的發(fā)生發(fā)展；第 2 階段為胎盤因子進入母體血液循環(huán)引起器官受損及相關(guān)臨床癥狀[13]。氧化應(yīng)激是指機體受到刺激時引起的氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡的一種狀態(tài)，滋養(yǎng)細胞侵襲不足引起妊娠早期母體子宮螺旋動脈重塑障礙，胎盤灌注不足、缺血缺氧，最終發(fā)生氧化應(yīng)激，引起ROS的積聚，參與子癇前期的發(fā)生發(fā)展[14]。

氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS可激活NLRP3炎癥小體并參與細胞焦亡途徑[15-16]。本研究通過對臨床標(biāo)本進行焦亡相關(guān)分子檢測，發(fā)現(xiàn)子癇前期患者體內(nèi)存在滋養(yǎng)細胞焦亡通路的激活，提出假設(shè)，滋養(yǎng)細胞侵襲不足，子宮螺旋動脈重塑障礙，胎盤灌注不足，胎盤界面缺血-再灌注損傷，胎盤界面滋養(yǎng)細胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，ROS積聚， 誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞焦亡，釋放炎癥因子，參與子癇前期發(fā)生發(fā)展，引起相關(guān)臨床癥狀。H2O2是研究細胞氧化應(yīng)激損傷的一種重要的活性氧，極易透過細胞膜形成高活性的自由基，是構(gòu)建滋養(yǎng)細胞HTR-8/ SVneo發(fā)生氧化應(yīng)激損傷模型中常用工具[17-18]。HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細胞系是第一個絨毛外細胞滋養(yǎng)層細胞系，常用于研究滋養(yǎng)細胞侵襲、增殖及調(diào)節(jié)功能[19-20]。侵襲表型的絨毛外滋養(yǎng)細胞在對母體子宮蛻膜及淺肌層侵襲過程中可分化為間質(zhì)表型絨毛外滋養(yǎng)細胞，HTR-8/ SVneo細胞系含有上皮細胞和間充質(zhì)細胞，可解釋上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象[21]，為驗證上述假設(shè)，本研究選擇H2O2誘導(dǎo)HTR-8/ SVneo滋養(yǎng)細胞焦亡模型，為后續(xù)探究子癇前期的發(fā)病機制提供實驗基礎(chǔ)。

在細胞焦亡經(jīng)典途徑中， NLRs為PRRs的一種，在病原微生物的刺激下，NLRP3受體通過接頭蛋白凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)與 caspase-1前體相連形成焦亡小體[22]，caspase-1/4/5/11裂解后特異性切割細胞中的 GSDMD 蛋白釋放其穿孔活性，GSDMD-N功能區(qū)域匯聚在細胞膜上形成12～14nm的微小孔洞，細胞內(nèi)外離子梯度形成，水分內(nèi)流，細胞腫脹，導(dǎo)致細胞滲透性裂解及成熟型炎性因子IL-1β和IL-18釋放到細胞外液中，最終引起炎癥反應(yīng)[23-24]。NLRP3炎性小體的活化包括“啟動”跟“激活”2個信號[25]，①啟動信號：NLRP3受體識別危險信號如ROS后通過NF- κB途徑對 NLRP3 和pro-IL-1β蛋白的轉(zhuǎn)錄水平進行調(diào)控；②激活信號：NLRP3受體激活后引起焦亡小體的構(gòu)象改變重新組裝。caspase-1的特異性裂解，Cleaved caspase-1對胞內(nèi)促炎因子前體進行加工修飾并使其成熟；同時Cleaved caspase-1對效應(yīng)分子GSDMD分子進行剪切，釋放其穿孔活性，最終導(dǎo)致成熟型促炎因子由胞內(nèi)借由膜上孔洞分泌到胞外進而誘發(fā)炎癥反應(yīng)的過程[26-27]。

根據(jù)本研究細胞焦亡經(jīng)典通路中關(guān)鍵分子的蛋白及mRNA水平，H2O2誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞焦亡模型的最佳條件是4h和150μmol/L，在該條件下，NLRP3焦亡小體的“啟動”跟“激活”2個信號通路都相繼誘導(dǎo)成功；焦亡經(jīng)典通路中上游“啟動”信號關(guān)鍵分子NLRP3及IL-1β的mRNA水平明顯上調(diào)(P<0.0001)，焦亡經(jīng)典通路中關(guān)鍵分子GSDMD及下游炎癥因子IL-18的mRNA水平也明顯高于對照組；同時，焦亡相關(guān)分子NLRP3、caspase1、Cleaved caspase1、GSDMD及IL-1β的蛋白水平明顯高于對照組，且隨著作用時間的延長，相應(yīng)分子的蛋白質(zhì)表達水平被抑制；在光鏡下明顯觀察到細胞腫脹、碎裂及質(zhì)膜氣泡形成等細胞焦亡典型改變。該模型從宏觀到微觀都檢測到相應(yīng)的細胞焦亡改變，H2O2誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞焦亡模型建立成功，體外模擬氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞發(fā)生焦亡損傷的病生理過程，為后續(xù)相關(guān)實驗提供一定的實驗基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究顯示在子癇前期發(fā)生發(fā)展中，滋養(yǎng)細胞侵襲不足引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS的積聚活化了NLRP3炎性小體，參與滋養(yǎng)細胞焦亡通路的激活，炎性因子釋放，引起炎癥相關(guān)臨床綜合征。本研究為更深入地了解子癇前期發(fā)病機制提供新的研究方向。目前實驗數(shù)據(jù)還未完善， 需要后續(xù)的動物模型進一步驗證，在氧化與抗氧化狀態(tài)下，體內(nèi)驗證胎盤界面氧化應(yīng)激反應(yīng)、滋養(yǎng)細胞焦亡及子癇前期發(fā)病機制之間的相關(guān)性，有利于我們對子癇前期發(fā)病機制及其病理生理過程更好的理解，從其作用機制通路中關(guān)鍵環(huán)節(jié)上進行干預(yù)將為子癇前期的診治及新藥的研發(fā)提供新的思路和方向。