徐溪悅，劉庶慈，湯安群，馬 文，鄭駿年，劉 丹，施 明

0 引 言

靶向CD19的嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T-cell, CAR-T)療法是治療B細胞惡性腫瘤的一項重大突破[1-2]。2017年，美國FDA批準了兩個靶向CD19 的CAR-T產(chǎn)品 (Yescarta和Kyriah)上市[3-4]。研究表明，接受CD19 CAR-T細胞治療的兒童和成人復發(fā)/難治性B細胞白血病患者可達到70%～90%的完全緩解(complete remission, CR)[5]。目前，有多個CD19 CAR-T產(chǎn)品在進行臨床研究和臨床試驗[6]。體外檢測CD19 CAR-T細胞對靶細胞的殺傷效應是CD19 CAR-T產(chǎn)品質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前使用的方法主要包括放射性同位素51Cr 釋放檢測、乳酸脫氫酶釋放檢測等[7]。這些方法均需要對靶細胞進行標記，操作繁瑣這些方法操作繁瑣，可重復性低，穩(wěn)定性差，且均為終點檢測法，無法實現(xiàn)對殺傷效應的實時監(jiān)測。

實時細胞分析(Real Time Cellular Analysis, RTCA)系統(tǒng)是基于電阻抗傳感器原理的細胞檢測技術(shù)。RTCA培養(yǎng)板底部設(shè)計有金屬微電子感應器，細胞在培養(yǎng)板底部貼壁生長可造成電阻改變。感應器監(jiān)測這些信號，從而實現(xiàn)對細胞活力、增殖和遷移等動態(tài)生物學過程的實時監(jiān)測[8-10]。目前，RTCA系統(tǒng)已被用于藥物療效評價等領(lǐng)域的研究[11-13]。但是，受限于RTCA的設(shè)計原理，其只適用于檢測貼壁生長的細胞。而CD19 CAR-T細胞的靶細胞為表達CD19的血液腫瘤細胞，為懸浮生長細胞，無法應用RTCA系統(tǒng)進行檢測。

CD19 CAR-T細胞在識別殺傷腫瘤細胞時，通過其細胞外結(jié)合域(通常由衍生自特異性靶向CD19的單克隆抗體的單鏈可變區(qū)組成)與表達在腫瘤細胞表面的靶抗原CD19相互接觸[14]，激活CD19 CAR-T細胞發(fā)揮殺傷功能。因此，在本研究中，我們建立了穩(wěn)定過表達CD19且具有貼壁生長特性的腫瘤細胞株。以該細胞株為靶細胞，能在很大程度上反映CD19 CAR-T細胞對表達CD19的血液腫瘤細胞的殺傷效應，并應用RTCA系統(tǒng)實現(xiàn)了對CD19 CAR-T細胞體外殺傷功能的無標記和實時檢測。

1 材料與方法

1.1 材料人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、SKBR3購自美國ATCC生物標準品資源中心，DMEM培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司；胎牛血清購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；PE標記的抗人CD19抗體購于天津三箭生物技術(shù)股份有限公司；嘌呤霉素購于微科曼得生物工程有限公司；慢病毒LV-CD19-GFP購于上海吉凱基因科技有限公司；Polybrene購于美國Sigma公司；主要儀器包括xCELLigence RTCA DPlus實時無標記細胞分析儀及E-Plate 16 PET為安捷倫生物有限公司產(chǎn)品、倒置熒光顯微鏡為日本奧林巴斯公司產(chǎn)品、二氧化碳孵育箱為力康生物醫(yī)療科技控股有限公司產(chǎn)品、流式細胞儀(FACSCanto II)及流式細胞分選儀(FACSAria III)為美國BD公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)人乳腺癌細胞株MDA-MB-231、SKBR3接種于含10%胎牛血清(FBS)的 DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗；CD19 CAR-T細胞和BCMA CAR-T細胞由本實驗室制備[15-17]。

1.2.2應用慢病毒載體構(gòu)建過表達CD19的貼壁生長腫瘤細胞分別將人乳腺癌細胞MDA-MB-231和SKBR3接種于6孔板中。接種細胞量為7.5×105細胞/孔。待細胞貼壁后，應用過表達CD19的慢病毒(LV-CD19-GFP)感染MDA-MB-231和SKBR3細胞，復感染指數(shù)(multiplicity of infection, MOI)分別為10和17。同時加入感染增強劑Polybrene，以增加慢病毒感染效率。慢病毒感染細胞24 h后，加入嘌呤霉素(Puromycin)至終濃度為2 μg/mL，藥物加壓篩選感染陽性的細胞。本研究中使用的過表達CD19的慢病毒載體為雙順反子系統(tǒng)，可同時獨立表達CD19和綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)。因此，病毒感染細胞72 h后，用熒光成像觀察GFP陽性細胞比例，以評估慢病毒感染效率。熒光顯微鏡觀察時，未感染LV-CD19-GFP的細胞作為陰性對照細胞，明場成像作為熒光成像的對照，可反映慢病毒的感染效率。

1.2.3流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞株過表達CD19的效果應用PE標記的抗人CD19抗體對嘌呤霉素加壓篩選后的細胞進行染色，以母本細胞作為對照細胞。取1×106個細胞，PBS緩沖液洗滌2次。用100 μL PBS重懸細胞，加入PE標記的抗人CD19抗體，冰上孵育30min。細胞經(jīng)PBS洗滌2次后上BD FACSCanto II流式細胞儀檢測，應用Novoexpress軟件分析實驗結(jié)果。

1.2.4流式細胞分選法建立穩(wěn)定過表達CD19的單克隆細胞株將過表達CD19的SKBR3細胞用PE標記的抗人CD19抗體進行染色，使用BD FACSAria III 流式細胞儀分選CD19陽性細胞，按照1細胞/孔接種至96孔板。單克隆細胞擴大培養(yǎng)后，應用流式細胞術(shù)檢測各個細胞克隆的CD19表達水平。選取高表達CD19的細胞株保種，命名為SKBR3/CD19，將該細胞用于后續(xù)RTCA檢測實驗。

1.2.5RTCA檢測CD19 CAR-T細胞的體外殺傷功能向RTCA檢測板(E-Plate 16 PET)中加入50 μL培養(yǎng)基并測定背景阻抗值。收集對數(shù)生長期的SKBR3、SKBR3/CD19、MDA-MB-231、MDA-MB-231/CD19細胞并計數(shù)，調(diào)整細胞懸液濃度至4×105個/mL。E-Plate每孔中加入50 μL的細胞懸液，即每孔2×104個細胞，超凈臺內(nèi)放置30 min。將E-Plate放置于儀器的檢測臺上，檢測條件37 ℃、5% CO2，進行實時檢測。以CD19 CAR-T細胞為效應細胞，以BCMA CAR-T細胞為對照效應細胞，效靶比(E:T)設(shè)定為5∶1、1∶1和1∶5。20 h后，按照不同效靶比，分別向各培養(yǎng)孔中加入CD19 CAR-T細胞/BCMA CAR-T細胞，繼續(xù)進行實時檢測。因CAR-T細胞為懸浮細胞，RTCA無法記錄其信號，RTCA記錄的校正細胞指數(shù)(Normalized Cell Index, NCI)反映貼壁生長的靶細胞的信號，NCI降低表明靶細胞被殺傷。因此，應用RTCA記錄的NCI可反映CAR-T細胞對靶細胞的殺傷效應。

2 結(jié) 果

2.1構(gòu)建過表達CD19的MDA-MB-231細胞熒光成像結(jié)果顯示，大部分的細胞呈現(xiàn)GFP陽性，提示慢病毒感染效率高，見圖1。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，經(jīng)嘌呤霉素加壓篩選后，99.03%的MDA-MB-231/CD19細胞為CD19陽性表達，而母本MDA-MB-231細胞為CD19陰性表達，見圖2。

圖 1 熒光成像檢測慢病毒感染MDA-MB-231細胞的效率(100 μm)

a:MDA-MB-231; b:MDA-MB-231/CD19

2.2構(gòu)建過表達CD19的SKBR3細胞株熒光成像結(jié)果顯示，大部分的細胞呈現(xiàn)GFP陽性，提示慢病毒感染效率高，見圖3。經(jīng)嘌呤霉素加壓篩選后，SKBR3/CD19細胞中CD19陽性細胞為83.10%，存在17%左右的CD19陰性細胞。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，單克隆細胞株CD19陽性細胞為98.91%左右，而母本SKBR3細胞為CD19陰性表達，見圖4。

a:SKBR3; b:SKBR3/CD19; c:單克隆細胞株CD19

2.3CD19 CAR-T細胞殺傷功能檢測以MDA-MB-231和MDA-MB-231/CD19細胞為靶細胞時，在效靶比為5∶1、1∶1和1∶5的情況下，CD19 CAR-T細胞可有效殺傷MDA-MB-231/CD19細胞，但對MDA-MB-231細胞無明顯殺傷作用。BCMA是B細胞成熟抗原，MDA-MB-231或SKBR3均不表達BCMA。BCMA CAR-T細胞對MDA-MB-231/CD19或MDA-MB-231均無明顯殺傷作用。以SKBR3和SKBR3/CD19為靶細胞，在效靶比為5∶1和1∶1時，CD19 CAR-T細胞可顯著殺傷SKBR3/CD19細胞，而BCMA CAR-T細胞對SKBR3/CD19細胞無顯著的殺傷效應。在效靶比為1∶5時，CD19 CAR-T細胞對SKBR3/CD19細胞無明顯的殺傷效應。見圖5。將MDA-MB-231/CD19作為靶細胞，CD19 CAR-T作為效應細胞的數(shù)據(jù)單獨分析，在靶細胞數(shù)量一致的情況下，RTCA檢測到的殺傷效應隨CD19 CAR-T細胞的數(shù)量增加而增加。

a-c：分別為效應靶比為5∶1、1∶1和1∶5時，MDA-MB-231或MDA-MB-231/CD19細胞NCI的變化情況；d-f：分別為效應靶比為5∶1、1∶1和1∶5時，SKBR3或SKBR3/CD19細胞NCI的變化情況

將SKBR3/CD19作為靶細胞，CD19 CAR-T作為效應細胞的數(shù)據(jù)單獨分析，在靶細胞數(shù)量一致的情況下，RTCA檢測到的殺傷效應隨CAR-T細胞的數(shù)量增加而增加，見圖6。

a：MDA-MB-231/CD19細胞作為靶細胞，CD19 CAR-T細胞作為效應細胞；b：SKBR3/CD19細胞作為靶細胞，CD19 CAR-T細胞作為效應細胞

3 討 論

CAR-T細胞是一種體外制備的免疫細胞治療產(chǎn)品，存在T細胞來源的個體差異大、制備工藝不成熟以及生物學效力評價復雜等問題[18]。因此，質(zhì)量評估研究對于保障CAR-T細胞產(chǎn)品的安全、有效性具有重要意義。與目前的藥品制劑質(zhì)量評價方式不同，CAR-T細胞產(chǎn)品作為一種活細胞“藥物”，需對細胞純度、活細胞比率、微生物安全性以及生物學效力等進行評估[19]，其中CAR-T細胞對靶細胞殺傷活性的評價與其療效密切相關(guān)，是CAR-T細胞產(chǎn)品質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

目前，檢測免疫細胞體外殺傷效率的方法主要包括核素法、酶釋放法和化學發(fā)光法等。核素法，如同位素51Cr 釋放檢測法，是評價免疫細胞殺傷功能的經(jīng)典方法[20]。用51Cr標記靶細胞，檢測靶細胞受損或死亡時釋放到細胞外的51Cr放射活性即可計算出效應細胞對靶細胞的殺傷效率。但標記后的靶細胞可自發(fā)釋放51Cr，且51Cr半衰期短。此外，51Cr是放射性物質(zhì)，操作存在安全隱患。酶釋放法，如乳酸脫氫酶釋放法，其檢測原理與核素法相似。此法雖無需標記，避免了同位素檢測法的放射性污染問題，但其可重復性低，穩(wěn)定性較差。而且，效應細胞也能釋放乳酸脫氫酶，干擾結(jié)果。化學發(fā)光法包括熒光素酶生物發(fā)光檢測法等。建立穩(wěn)定表達熒光素酶的靶細胞系，通過測定熒光信號值的高低即可代表存活靶細胞的數(shù)目，從而計算出效應細胞的殺傷效率。但是，該方法需要裂解靶細胞釋放熒光素酶或添加底物檢測存活靶細胞中熒光素酶的活性等繁瑣步驟，檢測費時費力。更為重要的是，上述3種方法檢測CAR-T細胞殺傷功能時，僅能評估單一時間點的殺傷效應。檢測CAR-T細胞殺傷靶細胞的動態(tài)變化過程，需要檢測多個時間點，使工作量大大增加。

RTCA系統(tǒng)可用于評價CAR-T細胞對貼壁腫瘤細胞的殺傷效應。而表達CD19的血液腫瘤細胞均為懸浮生長細胞，如果用這些細胞作為靶細胞，無法使用RTCA系統(tǒng)檢測CD19 CAR-T細胞的殺傷活性。

在本研究中，我們構(gòu)建了貼壁生長且穩(wěn)定過表達CD19的腫瘤細胞，以其作為靶細胞，結(jié)合RTCA系統(tǒng)建立了一種體外檢測CD19 CAR-T細胞殺傷活性的方法。該方法與核素法相比，避免了自發(fā)釋放及同位素的安全隱患問題；與酶釋放法相比，避免了效應細胞的干擾問題，可重復性好、靈敏度高；與化學發(fā)光法相比，操作簡便，穩(wěn)定性和準確性高。并且使用RTCA系統(tǒng)，可通過一次實驗對CD19 CAR-T細胞殺傷靶細胞的全部過程進行動態(tài)實時監(jiān)測，無需對靶細胞進行標記，省時省力。該方法的實驗結(jié)果以動態(tài)殺傷曲線的形式展示，簡潔明了，可實現(xiàn)對CD19 CAR-T細胞的體外殺傷生物學效力評價。本研究建立的實驗方法未來可能應用于CD19 CAR-T細胞產(chǎn)品的質(zhì)量評估。