李根亮，倪安妮，唐玉蓮，馮 權(quán)，黃小程，阮文慧，李曙波，陸瑞群

0 引 言

癌癥發(fā)生起始于正常體細(xì)胞突變成永生的癌細(xì)胞。在這一過程中，癌基因和抑癌基因突變，逆轉(zhuǎn)錄酶和生長因子異常激活[1-2]。這些變化使會走向死亡的體細(xì)胞去分化，從而開始新的不斷分裂增殖的細(xì)胞周期。細(xì)胞增殖過程中，首先開始的是DNA復(fù)制，復(fù)制過程則起始于復(fù)制起始復(fù)合物的生成。微小染色體維持(mini chromosome maintenance，MCM)復(fù)合物在DNA復(fù)制起始中發(fā)揮著不可替代的作用[3-4]。當(dāng)MCM復(fù)合物與復(fù)制起始點結(jié)合時，能解開結(jié)合部位的雙鏈DNA，募集DNA聚合酶并啟動DNA合成。MCM功能失調(diào)會導(dǎo)致染色體缺陷，因此可能參與腫瘤發(fā)生[5]。MCM復(fù)合體組成蛋白常含有寡核苷酸結(jié)合(oligonucleotide binding，OB)折疊域。該結(jié)構(gòu)域能夠識別端粒結(jié)構(gòu)并招募端粒酶及其他相關(guān)蛋白構(gòu)成端粒復(fù)合物，以維持端粒的穩(wěn)定[6-7]。Zhu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在人肺癌細(xì)胞中，OB折疊域蛋白TPP1可通過抑制端粒酶向端粒的募集抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。OB折疊域蛋白基因(OB fold domain protein-encoding genes，OBGs)突變則會引起端粒的不穩(wěn)定，從而誘發(fā)腫瘤的發(fā)生[9-10]。肝癌的影響因素很多[11-12]，然而，OBGs異常在肝細(xì)胞癌中通過MCM復(fù)合物影響復(fù)制起始的相關(guān)作用報道較少。由于逆轉(zhuǎn)錄在癌癥發(fā)生中具有獨一無二的作用，因此，本研究旨在探討逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因(reverse transcription related genes，RTGs)在肝細(xì)胞癌中的作用及可變剪接和單核苷酸位點變異(single nucleotide variants，SNV)與基因表達(dá)異常的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 動物模型構(gòu)建及樣本獲取選取150只潔凈級昆明小鼠，鼠齡6周，體重(30±5)g。采用隨機(jī)數(shù)字表法取100只，雙前肢腋下注射對數(shù)生長期肝細(xì)胞癌細(xì)胞株H22等滲鹽水懸液作為H22組。細(xì)胞懸液密度105個細(xì)胞/mL，注射量0.2 mL；其余50只同樣方法注射0.2 mL不含H22的等滲鹽水作為對照組。小鼠正常飼養(yǎng)40 d。從H22組小鼠中選出成瘤小鼠，解剖取出瘤體；從對照組小鼠中取健康肝組織。

1.2 RNA提取和測序利用RNA提取試劑盒提取H22組和對照組各樣本總RNA，同組內(nèi)等量取各樣本總RNA混合成總RNA樣本。RNA-seq、質(zhì)量檢測、組裝及高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)(clean reads)篩選按常規(guī)程序完成[13]。

1.3 差異表達(dá)基因分析以小鼠基因組為背景對高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對、注釋和較正。以各基因匹配的clean reads為依據(jù)，統(tǒng)計分析每百萬reads中來自于某基因每千堿基長度的reads數(shù)(reads per kilo bases per million reads，RPKM)的差異。以H22組和對照組同一基因之間的RPKM比值≥2或≤0.5，且錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)≤0.05的基因為差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)。

1.4 RDEGs的篩選以"Reverse transcript(逆轉(zhuǎn)錄)"為關(guān)鍵詞，在NCBI中的Nucleotide(核苷酸)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，將檢索結(jié)果通過DAVID在線轉(zhuǎn)換成Ensembl基因組數(shù)據(jù)庫的基因代碼和正式基因符號。將轉(zhuǎn)換結(jié)果與測序數(shù)據(jù)中的DEGs進(jìn)行比較，篩選出在2類樣本之間差異表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)DEGs(reverse-transcription-related DEGs，RDEGs)。

1.5 RDEGs的功能分析利用DAVID 6.8軟件(https://david.ncifcrf.gov)對RDEGs進(jìn)行GO和KEGG分析，并對富集到的生物學(xué)程序、細(xì)胞組分、分子功能、信號通路和功能部位等進(jìn)行功能注釋聚類，其中FDR≤0.05的為有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.6 RDEGs編碼蛋白的互作分析通過STRING 11.0版本(https://string-db.org)在線對RDEGs編碼蛋白進(jìn)行互作分析，以評價其在表達(dá)上的相關(guān)性及其中發(fā)揮功能的關(guān)鍵分子。

1.7 RDEGs多態(tài)性與基因表達(dá)的相關(guān)性分析利用Excel軟件，對RDEGs中出現(xiàn)的可變剪接、SNV及插入-刪除(insertion-deletion，INDEL)等基因多態(tài)性變異進(jìn)行χ2檢驗，其中P<0.05且2樣本間發(fā)生頻率的倍數(shù)≥2的為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同時，對OBGs的可變剪接和SNV/INDEL進(jìn)行位點分布分析，探討基因的突變情況。

1.8 RT-qPCR驗證RDEGs隨機(jī)選擇4個在2類樣本中均表達(dá)的RDEGs，進(jìn)行RT-qPCR分析，用以驗證RNA-seq結(jié)果。PCR條件參照文獻(xiàn)[13]，引物利用Blast-primer軟件設(shè)計，由上海生工進(jìn)行合成。

2 結(jié) 果

2.1 測序數(shù)據(jù)H22組和對照組分別獲得了5.01G base(35.28M clean reads)和5.02G base(35.32M clean reads)的數(shù)據(jù)。H22組和對照組所得clean reads對基因組的匹配率分別為93.65%和89.20%，且2組測序數(shù)據(jù)的Q20皆>99%。表明本研究測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量較高，能滿足后續(xù)分析的需要。

2.2 RDEGs分析H22組和對照組總共有4533個DEGs。RTGs檢索結(jié)果顯示，在nucleotide數(shù)據(jù)庫中共存在28123個與逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)的核苷酸序列。DAVID6.8軟件共成功注釋到9264個基因，與DEGs匹配的RDEGs有193個，其中77個上調(diào)表達(dá)，116個下調(diào)表達(dá)。隨機(jī)選擇4個在H22組和對照組樣本中均表達(dá)的RDEGs(Gclc、Gclm、Comt、Agt)進(jìn)行RT-qPCR分析，內(nèi)參基因為Rn18s，肝細(xì)胞癌中這4個基因的表達(dá)皆下調(diào)，該結(jié)果與RNA-seq結(jié)果一致，見圖1。引物序列見表1。

圖1 RT-qPCR與RNA-seq分析肝細(xì)胞癌和健康肝組織中RDEGs的表達(dá)情況

表 1 RT-qPCR引物

2.3 RDEGs的功能分析功能富集分析結(jié)果顯示，本研究所得193個RDEGs共富集到2個生物學(xué)程序、3個細(xì)胞組分、1個分子功能、3個信號通路和3個功能部位。其中，2個生物學(xué)程序為：DNA復(fù)制起始和凋亡過程的負(fù)調(diào)控；3個細(xì)胞組分為：核染色體端粒區(qū)、膜和MCM復(fù)合體；1個分子功能為：損傷DNA的結(jié)合；3個信號通路為：細(xì)胞周期、DNA復(fù)制和錯配修復(fù)；3個功能部位為：核酸結(jié)合的OB-折疊、微型染色體維持的保守位點、微型染色體維持相關(guān)DNA依賴的ATP酶。其中，除了負(fù)調(diào)控凋亡程序及膜組分中存在下調(diào)表達(dá)基因外，參與其他10個功能的基因，如構(gòu)建MCM復(fù)合體和復(fù)制起始復(fù)合體的RDEGs，皆上調(diào)表達(dá)。除了功能紊亂的細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)控和膜組分外，RDEGs的功能主要集中在生物學(xué)程序中的DNA復(fù)制起始、細(xì)胞組分中的MCM復(fù)合物和核染色體端粒區(qū)，并通過細(xì)胞周期中的DNA復(fù)制和錯配修復(fù)的信號通路及損傷DNA結(jié)合的分子功能來實現(xiàn)相關(guān)功能。能與核酸結(jié)合的OBGs功能包括DNA復(fù)制起始、MCM復(fù)合物構(gòu)建、通過保守位點和DNA依賴的ATP酶的MCM。見圖2、圖3。

紅星表示該基因上調(diào)表達(dá)

圖 3 RDEGs編碼蛋白的互作關(guān)系

2.4 肝細(xì)胞癌及健康肝組織中的可變剪接和SNV/INDEL可變剪接分析結(jié)果顯示，4個RDEGs在基因的3個位點發(fā)生了差異表達(dá)的可變剪接，即第一個外顯子可變剪切、最后一個外顯子可變剪切、單內(nèi)含子滯留(包括ON及OFF 2種)，且可變剪接與相應(yīng)基因的表達(dá)呈正相關(guān)，即Cd81和Agt的可變剪接和基因表達(dá)皆下調(diào)，Lsm3和Mycr的可變剪接和基因表達(dá)皆上調(diào)。結(jié)果表明，可變剪接在基因表達(dá)中可能起著正調(diào)控作用。

SNV和INDEL分析顯示，肝細(xì)胞癌組織中共有157個RDEGs,發(fā)生了1541個SNV和78個INDEL位點的改變。上述基因位點的改變主要發(fā)生在基因的6個部位，即外顯子區(qū)、內(nèi)含子區(qū)、基因間區(qū)、基因下游區(qū)、基因上游區(qū)和拼接區(qū)。上述核苷酸位點發(fā)生改變的基因中，共有28個基因的SNV改變差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中26個基因的SNV改變與其基因的表達(dá)呈正相關(guān)。但是，INDEL的改變與相關(guān)基因的表達(dá)沒有明顯的相關(guān)性(P>0.05)?；蛭稽c多態(tài)性分析結(jié)果顯示，5個OBGs(Mcm2、Mcm3、Mcm5、Mcm6、Rpa2)在肝細(xì)胞癌中出現(xiàn)了SNV，而健康肝組織中則沒有SNV，見表2。上述SNV全部發(fā)生在外顯子區(qū)，且其中4個OBGs參與MCM復(fù)合物構(gòu)建。

表 2 肝細(xì)胞癌中OB折疊域蛋白編碼基因內(nèi) SNV的發(fā)生情況

3 討 論

無論在生殖細(xì)胞發(fā)生，還是在體細(xì)胞癌變中，逆轉(zhuǎn)錄都是關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞癌組織中的RDEGs參與DNA復(fù)制，尤其OBGs參與的MCM復(fù)合體及DNA復(fù)制起始。本研究結(jié)果顯示，在MCM六聚復(fù)合體中有5個組分的基因在肝細(xì)胞癌中上調(diào)表達(dá)，包括Mcm2、Mcm3、Mcm5、Mcm6和Mcm7。MCM復(fù)合體是復(fù)制起始和復(fù)制調(diào)控所必需的。Patterson等[14]發(fā)現(xiàn)，MCM復(fù)合物參與惡性瘧原蟲非典型DNA復(fù)制周期中的復(fù)制前復(fù)雜組織形成。Hiraga等[15]發(fā)現(xiàn)，在MCM復(fù)合物控制DNA復(fù)制的過程中，Rif1通過指導(dǎo)蛋白磷酸酶1逆轉(zhuǎn)Cdc7介導(dǎo)的磷酸化來實現(xiàn)。MCM復(fù)合體異?？赡芘c癌癥發(fā)生相關(guān)[5]。而且，上調(diào)表達(dá)的5個MCM復(fù)合體組分都具有OB折疊域。OB折疊域又稱寡核苷酸/寡糖結(jié)合基序[16]。OB折疊域蛋白屬于核酸結(jié)合蛋白，如ssDNA結(jié)合蛋白CDC13、DNA連接酶、DNA復(fù)制啟始子、KREPA4等[16-18]。因此，OB折疊域在DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯中具有廣泛的作用。Gao等[19]還發(fā)現(xiàn)，OB折疊復(fù)合物控制DNA雙鏈斷裂的修復(fù)途徑。在肺癌細(xì)胞中，OB折疊域蛋白具有抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能[8]，但其基因的突變可能引起端粒的不穩(wěn)定從而起始腫瘤的發(fā)生或引起端粒復(fù)制和復(fù)制應(yīng)激的異常[8,20-21]。

涉及復(fù)制起始的RDEGs包括Cdc6、Mcm7、Orc6、Mcm2、Mcm3、Mcm5和Mcm6，它們與另外5種RDEGs：Rpa2、Rfc3、Rfc4、Pcna和Rpa3，共同參與DNA的復(fù)制過程。這些基因中，Rpa2和Rpa3也屬于OBGs。以上基因中的7種，即Rpa2、Mcm7、Pcna、Mcm2、Mcm3、Mcm5和Mcm6，及另外4個RDEGs：Cdk1、Thoc6、Orc1和Orc2，還參與核染色質(zhì)中端粒區(qū)域的構(gòu)建。端粒長度的維持是長壽及細(xì)胞干性的重要原因[2]。而細(xì)胞去分化、突變細(xì)胞的癌變、配子的發(fā)生都與逆轉(zhuǎn)錄酶的激活相關(guān)[1]。本研究發(fā)現(xiàn)與端粒相關(guān)的多種基因在肝細(xì)胞癌中上調(diào)表達(dá)，表明肝細(xì)胞癌細(xì)胞中參與逆轉(zhuǎn)錄及端粒維持的蛋白組分可能過量表達(dá)。由于大量的端粒復(fù)合體相關(guān)基因含有OB折疊域，因此OB折疊域可能與這些端粒復(fù)合體相關(guān)基因的功能相關(guān)。

本研究GO分析結(jié)果還表明，這些基因中的3種，即Rpa2、Pcna和Rpa3，與另外4種上調(diào)表達(dá)的RDEGs：Msh6、Polh、Xrcc1和Ogg1，共同參與損傷DNA的結(jié)合和修復(fù)，并協(xié)同調(diào)控癌細(xì)胞的細(xì)胞周期。KEGG分析同樣表明，上調(diào)表達(dá)的RDEGs也參與以上GO功能相關(guān)的3個信號通路，即細(xì)胞周期、DNA復(fù)制和錯配修復(fù)等。上述結(jié)果表明，在肝細(xì)胞癌中的RDEGs，尤其MCM復(fù)合體的異常在改變復(fù)制起始中發(fā)揮著極其重要的作用。而OB折疊域則在參與肝細(xì)胞癌中MCM復(fù)合體構(gòu)建及復(fù)制相關(guān)其他功能如端粒復(fù)合體構(gòu)建、DNA復(fù)制中的錯配修復(fù)等中發(fā)揮著廣泛的作用。本研究中RDEGs編碼蛋白的互作分析同樣說明了肝細(xì)胞癌中OBGs在這些功能上的重要性和相關(guān)性。

本研究中的可變剪接分析結(jié)果進(jìn)一步表明，引起基因多態(tài)性的遺傳因素可變剪接與基因表達(dá)呈正相關(guān)。另外，在肝細(xì)胞癌組織中，SNV的改變與其基因的表達(dá)呈正相關(guān)，而INDEL則與基因的表達(dá)無明顯的相關(guān)性。也就是說，可變剪接和SNV引起的基因多態(tài)性在肝細(xì)胞癌中扮演著調(diào)控基因表達(dá)的重要功能。但有2個基因的SNV改變與相關(guān)基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說明基因表達(dá)的調(diào)控是多層次的，還有一些調(diào)控方式可能改變了SNV對特定基因表達(dá)的正調(diào)控功能。這還有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果還顯示，肝細(xì)胞癌中上調(diào)表達(dá)的OBGs多具有SNV現(xiàn)象。OB折疊域蛋白具有抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的功能，但突變后則會影響這些功能?；蚨鄳B(tài)性與基因編碼蛋白的功能改變密切相關(guān)[9,22]。OBGs的多態(tài)性參與腫瘤發(fā)生和促進(jìn)癌細(xì)胞生存[9-10,20-21]。因此，OBGs中的SNV可能在肝細(xì)胞癌發(fā)生中起著重要作用，如異常起始DNA的復(fù)制、招募端粒酶延長端粒等。

綜上所述，RDEGs中的OBGs可能在肝細(xì)胞癌中通過自身的基因多態(tài)性突變引起MCM復(fù)合體及端粒復(fù)合體的改變，從而調(diào)控DNA復(fù)制起始及保護(hù)端粒的完整性，進(jìn)而在癌細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮重要作用。而可變剪接及SNV則可能是一些基因上調(diào)表達(dá)的重要調(diào)控因素。