張永杰，林 飛，閆志剛，劉慧兵，孫四玉，王立波，趙國安

0 引 言

心血管疾病成為全球疾病死亡的首要原因，冠心病是心血管疾病死亡的重要組成部分，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。冠心病的主要病理基礎(chǔ)為動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)，內(nèi)皮功能障礙是As發(fā)生的啟動(dòng)環(huán)節(jié)[2]，氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[3]，促進(jìn)As的發(fā)生發(fā)展。因此，探討內(nèi)皮細(xì)胞凋亡途徑將為As的機(jī)制研究提供新視角。

miRNA是一種長度約為22～24個(gè)核苷酸的短鏈非編碼RNA，主要通過與靶基因mRNA3′-非編碼區(qū)(3′-UTR)結(jié)合，調(diào)控靶基因蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能(生長、分化、增值及凋亡)。在AS研究中miRNA參與斑塊形成到斑塊不穩(wěn)定至破裂的整個(gè)過程，并調(diào)節(jié)內(nèi)皮及免疫功能[4]。miR-133a不僅與斑塊穩(wěn)定性有關(guān)，與冠心病同樣相關(guān)[5-6]。另外，高血糖、高血脂、高同型半胱氨酸均可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞miR-133a增高，促使血管內(nèi)皮功能紊亂，而抑制miR-133a可保護(hù)內(nèi)皮功能，阻止AS的發(fā)生[7]。miR-133a是否參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，文獻(xiàn)報(bào)道較少。B淋巴細(xì)胞瘤因子2-特大型(B-cell lymphoma extra large, Bcl-xl)在細(xì)胞線粒體凋亡途徑中扮演重要角色[8]，miR-133a可靶向調(diào)節(jié)Bcl-xl[9-11]。本研究旨在探討miR-133a靶向調(diào)節(jié)Bcl-xl參與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程，為As的機(jī)制研究及治療靶點(diǎn)提供可參數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料原代人冠狀內(nèi)皮細(xì)胞(human coronal endothelial cells, HCAECs)及內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(endothelial cell medium, ECM)購于美國Sciencell公司，ox-LDL購于北京索萊寶生物有限公司，MTT、BCA試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記Annexin V(Aposcreen Annexin V-FITC，Annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide, PI)雙染試劑盒和纖連蛋白購于美國BD生物技術(shù)公司，miRNA(miR-133a、miR-324、miR-133b、let-7c、let-7g、miR-491、miR-326、miR-608)、Bcl-xl及GAPDH引物合成于上海生工生物工程股份有限公司，miRNA 及mRNA反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR試劑盒購于TaKaRa公司，miRNA 沉默(inhibitor)、過表達(dá)(mimics)、無義序列(NC)、沉默無義序列(inhibitor NC, in NC)由上海吉瑪基因生物有限公司合成，脂質(zhì)體Lipofectamine RNAiMAX Reagent購買于賽默飛世爾科技公司，RIPA蛋白裂解液購于上海雅酶生物科技有限公司，兔抗Bcl-xl及兔抗caspase3購于美國Cell Signaling Technology公司，鼠抗β-actin購于美國Proteintech生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)首先纖連蛋白包被培養(yǎng)瓶(板)，用含5%胎牛血清及含有內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的ECM于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培育、傳代，第3-7代用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞處理HCAECs接種96孔板，分別給予不同濃度(5、15、25、50、75 μg/mL)的ox-LDL處理12、24 h。HCAECs接種于6孔板，加入ox-LDL(濃度25、50、75 μg/mL)處理24 h。

1.4 細(xì)胞活力檢測(cè)ox-LDL分別處理細(xì)胞12 h及24 h加入MTT(20 μL/孔)，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，加二甲基亞砜150 μL溶解藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)A490nm波長吸收值。計(jì)算細(xì)胞活力公式如下：

細(xì)胞活力=(處理組A值-空白組A值)/(對(duì)照組A值-空白組A值)×100%

1.5 miRNA篩選采用生物信息學(xué)方式(網(wǎng)站http://www.mirbase.org)篩選文獻(xiàn)證實(shí)靶向調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白Bcl-xl的miRNA(miR-133a、miR-324、miR-133b、let-7c、let-7g、miR-491、miR-326、miR-608)。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代至6孔板，生長至60%～70%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine?RNAiMAX Reagent轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，應(yīng)用Opt-MEM分別稀釋miR-133a inhibitor、in NC、miR-133a mimics、NC(轉(zhuǎn)染混合液A)及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?RNAiMAX Reagent(轉(zhuǎn)染混合液B)，轉(zhuǎn)染混合液A及轉(zhuǎn)染混合液B按1∶1體積充分混勻，室溫孵育5 min后滴入6孔板，輕搖均勻，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱。轉(zhuǎn)染48 h后分為：無義序列組(無義序列NC)、過表達(dá)組(過表達(dá)miR-133a mimics)、沉默無義序列+誘導(dǎo)組(in NC+ox-LDL誘導(dǎo)HCAECs)、miRNA沉默+誘導(dǎo)組(miR-133a敲減inhibitor+ox-LDL誘導(dǎo)HCAECs)。無義序列組、過表達(dá)組給予更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；沉默無義序列+誘導(dǎo)組、miRNA沉默+誘導(dǎo)組更換含ox-LDL終濃度為75 μg/mL的新鮮培養(yǎng)基溫箱孵育24 h。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè)應(yīng)用Annexin V-FITC / PI雙染試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，0.05%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS清洗2遍，1×結(jié)合緩沖液100 μL重懸細(xì)胞，分別加Annexin V-FITC及PI各5 μL室溫避光輕輕震蕩15 min染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。FlowJo 7.6軟件定量分析，以Annexin V-FITC陽性為凋亡細(xì)胞(早期凋亡Q2及晚期凋亡Q3象限)。

1.8 qRT-PCR檢測(cè)預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞2遍，加入RNAisoplus試劑裂解細(xì)胞，混勻震蕩后冰上裂解10 min；加入三氯甲烷200 μL，冰上靜置15 min后，4 ℃離心機(jī)12 000×g，離心15 min；加入異丙醇500 μL，冰上靜置10 min，4 ℃離心機(jī)，12 000×g，離心10 min，棄上清保留沉淀，75%乙醇清洗沉淀后應(yīng)用DEPC水溶解。超微量分光光度儀檢測(cè)RNA濃度及純度(A260/A280比值在1.8～2.0 )。TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行miRNA及mRNA反轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè)miRNA、Bcl-xl表達(dá)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 Western blot分析RIPA法提取總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。等量上樣，用12%的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠(20 μg/孔)，15%的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠(30 μg/孔)進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。孵育以下抗體：兔抗Bcl-xl(稀釋1∶2000)、兔抗caspase3(稀釋1∶500)、鼠抗β-actin(稀釋1∶2000)，4 ℃孵育過夜。次日清洗PVDF膜后，室溫孵育二抗(稀釋1∶5000)1.5 h，化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)成像顯影，ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力細(xì)胞處理12、24 h，ox-LDL低濃度(5、15 μg/mL)時(shí)對(duì)HCAECs活力無顯著抑制(P>0.05)，ox-LDL濃度增加至 25、50、75 μg/mL時(shí)細(xì)胞活力較0 μg/mL降低(P<0.05)；細(xì)胞處理24 h， ox-LDL 75 μg/mL的細(xì)胞活力[(47.21±2.44)%]較0 μg/mL [(100±1.18)%]明顯降低(P<0.001)，見圖1。

與0 μg/mL 比較， *P<0.05、**P<0.01、***P<0.001；50 μg/mL與75 μg/mL比較，#P<0.05；25 μg/mL與75 μg/mL比較，##P<0.01

2.2 qRT-PCR結(jié)果qRT-PCR結(jié)果顯示miR-133a異常增高，見圖2。ox-LDL 0 μg/mL的Bcl-xl mRNA表達(dá)水平(1±0.28)與25 μg/mL(1.22±0.18)、50 μg/mL(1.38±0.22)、75 μg/mL(1.19±0.16)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。過表達(dá)組細(xì)胞中miR-133a表達(dá)量(41.80±8.94)較無義序列組(1±0.31)明顯增高(P<0.01)。miRNA沉默+誘導(dǎo)組細(xì)胞中miR-133a表達(dá)量(0.20±0.11)較沉默無義序列+誘導(dǎo)組(1±0.11)顯著降低(P<0.001)。

與0 μg/mL比較， *P<0.05、**P<0.01、***P<0.001

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率ox-LDL 75 μg/mL的細(xì)胞凋亡率[(28.97±3.20)%]較0 μg/mL [(8.03±0.73)%]明顯升高(P<0.01)，見圖3。miRNA沉默+誘導(dǎo)組細(xì)胞凋亡率(18.92±3.00)%]較沉默無義序列+誘導(dǎo)組[(27.1±2.01)%]明顯降低(P<0.05)，過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率[(14.81±2.60)%]較無義序列組 [(8.02±1.22)%]顯著增加(P<0.05)。ox-LDL誘導(dǎo)HCAECs的凋亡率隨著miR-133a的沉默降低。見圖4。

圖 3 不同濃度ox-LDL處理HCAECs 24 h流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

圖 4 HCAECs細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-133a后流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

2.4Bcl-xl及cleaved-caspase3蛋白表達(dá)隨著ox-LDL濃度(25、50、75 μg/mL)增加，抗凋亡蛋白Bcl-xl的表達(dá)量逐漸降低，cleaved-caspase3的表達(dá)量增加。見表1。過表達(dá)miR-133a之后其靶基因Bcl-xl表達(dá)量降低，而沉默miR-133a后ox-LDL誘導(dǎo)降低的Bcl-xl得到部分逆轉(zhuǎn)。見圖5。無義序列組Bcl-xl表達(dá)量(1.265±0.049)較過表達(dá)組(0.940±0.071)明顯升高(P<0.05)，沉默無義序列+誘導(dǎo)組(0.795±0.064)較miRNA沉默+誘導(dǎo)組(1.150±0.071)明顯降低(P<0.05)。

表 1 各組間Bcl-xl、cleaved-casepase3表達(dá)量

1：0 μg/mL； 2：25 μg/mL； 3：50 μg/mL； 4：75 μg/mL

3 討 論

內(nèi)皮作為血液與血管的生理屏障，在AS發(fā)生發(fā)展中起重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可增加平滑肌細(xì)胞增殖、遷移，促進(jìn)血液凝固，參與AS發(fā)生[12]。斑塊的不穩(wěn)定及破裂與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[13]。因此，內(nèi)皮凋亡途徑的探討將為AS機(jī)制研究及治療靶點(diǎn)提供可參數(shù)據(jù)。

在細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)中，抗凋亡蛋白Bcl-xl及Bcl-2可被凋亡啟動(dòng)蛋白Bid及其功能相近的因子結(jié)合隔離引起細(xì)胞色素c外流[14]，進(jìn)一步驅(qū)動(dòng)多分子復(fù)合物激活caspase3及caspase7執(zhí)行細(xì)胞凋亡[15]。Bcl-xl是Bcl-2-like1基因編碼的蛋白質(zhì)，為Bcl-2家族主要成員。在抗凋亡方面Bcl-xl優(yōu)于Bcl-2和Mcl-1[16]，過表達(dá)Bcl-xl可降低內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[17]，因此，Bcl-xl在凋亡研究中更具有價(jià)值。本研究結(jié)果再次證明ox-LDL可降低內(nèi)皮細(xì)胞Bcl-xl表達(dá)、激活caspase3，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

越來越多的證據(jù)表明miRNA參與AS形成的調(diào)節(jié)過程。miRNA-181b、miR-92a抗內(nèi)皮炎癥反應(yīng)[18-19]；miR-126-5p促進(jìn)內(nèi)皮損傷后修復(fù)[20]；miR-26a阻止內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[21]，均可保護(hù)內(nèi)皮功能，抑制AS。本研究通過靶基因反向推導(dǎo)miRNA，篩選差異表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-133a異常增高，且呈濃度依賴性，即隨著ox-LDL濃度(25～75 μg/mL)的增加miR-133a亦愈高。但是，靶基因Bcl-xl的mRNA水平各誘導(dǎo)組與對(duì)照組相比卻未見明顯差異，推測(cè)miR-133a可能通過結(jié)合Bcl-xl3′-UTR抑制蛋白翻譯過程，而并非降解mRNA。

miR-133a是miR-133家族(包括miR-133a和miR-133b)一員，miR-133a和miR-133b位于不同的染色體上[22]。miR-133a是肌肉特異性miRNA，在骨骼肌及心肌正常發(fā)育和功能中發(fā)揮必不可少的作用[23]。另外，miR-133a可被神經(jīng)緊張素上調(diào)，參與結(jié)腸炎的病理過程[24]。本研究首次發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-133a可增加內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率、降低Bcl-xl表達(dá)，而沉默miR-133a后ox-LDL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率的增高得到部分逆轉(zhuǎn)。提示miR-133a參與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程，并有成為治療As新靶點(diǎn)的可能。另外，研究還發(fā)現(xiàn)let-7c在各誘導(dǎo)組與對(duì)照組相比并不增高或降低，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[25]不同，文獻(xiàn)報(bào)道所涉及的研究對(duì)象為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，本研究為HCAECs，推測(cè)let-7c可能在不同組織內(nèi)皮細(xì)胞中存在差異。

綜上所述，本研究顯示miR-133a可抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl表達(dá)，引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，破壞血管內(nèi)皮完整性，促進(jìn)AS發(fā)生發(fā)展。