潘珊 周洪靖 劉愛(ài)群 葛蓮英

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)鏡中心

胃癌是全球第五大惡性腫瘤，也是癌癥死亡的第三大原因［1］。但早期胃癌缺乏典型的癥狀，大多數(shù)胃癌患者確診時(shí)已為晚期，5年生存率不足50%，其中胃癌腹膜轉(zhuǎn)移是造成患者預(yù)后較差的重要因素［2-3］。因此，尋找可用于早期診斷的靶點(diǎn)及闡明胃癌轉(zhuǎn)移發(fā)生的機(jī)制具有重要意義。微小RNA（miRNA）是一類(lèi)小的非編碼RNA分子，作為基因表達(dá)的內(nèi)源性抑制劑起作用，通過(guò)與靶基因的3′-非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合而負(fù)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而抑制翻譯和誘導(dǎo)靶基因mRNA降解［4］。已有研究報(bào)道 miR-1271-5p在肝癌［5］、結(jié)腸癌［6］和骨肉瘤［7］中低表達(dá)并發(fā)揮抑癌作用，可能是潛在的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物。本團(tuán)隊(duì)前期進(jìn)行在線(xiàn)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)，亦發(fā)現(xiàn)miR-1271-5p在胃癌中低表達(dá)，推測(cè)miR-1271-5p可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展。因此，本研究檢測(cè)miR-1271-5p在胃癌組織和不同胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，觀(guān)察過(guò)表達(dá)miR-1271-5p對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲等生物學(xué)功能的影響，以期闡明胃癌轉(zhuǎn)移機(jī)制及為早期診斷提供可靠的生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

收集2011年6月至2014年6月廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院90例手術(shù)切除胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織，將樣品保存在-80°C下。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞系和主要試劑

人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES1和胃癌細(xì)胞SGC-7901、AGS和MGC-803均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，miRNA模擬物和GP-siRNA-Mate Plus購(gòu)自蘇州GenePharma股份有限公司。Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。Mir-XTMmiRNA First-Stand Synthesis Kit和SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）試劑盒購(gòu)自美國(guó)TaKaRa公司。Cell Counting Kit-8購(gòu)自日本同仁公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES1和人胃癌細(xì)胞系SGC-7901、MGC-803、AGS均用含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～3 d用EDTA-胰蛋白酶消化液消化、傳代。

參照GP-siRNA-Mate Plus轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染miR-1271-5p mimics和miR-NC，記為過(guò)表達(dá)miR-1271-5p組和陰性對(duì)照組。將miRNA溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中孵育10 min，同時(shí)另取 GP-siRNA-Mate Plus加入Opti-MEM培養(yǎng)基中孵育5 min，混合后室溫靜置 15 min。將混合物加入各組細(xì)胞中，24 h后更換完全培養(yǎng)基，用qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取轉(zhuǎn)染24 h后的兩組細(xì)胞接種于96孔板中，每組 5 個(gè)復(fù)孔，分別于 24 h、48 h、72 h、96 h 后加入CCK-8工作液10 μL/孔，常規(guī)培養(yǎng)2 h后在酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD）值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力

取轉(zhuǎn)染24 h后計(jì)數(shù)兩組細(xì)胞，充分吹勻至單個(gè)懸浮細(xì)胞，以500/孔接種至預(yù)先加入5 mL完全培養(yǎng)基的6孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，混勻；2周后棄培養(yǎng)基，用PBS浸洗3次，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色1 h，風(fēng)干后拍照。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)miR-1271-5p的表達(dá)

采用TaKaRa公司Mir-XTMmiRNA First-Stand Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按試劑盒說(shuō)明書(shū)建立反應(yīng)體系，以U6為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量分析。miR-1271-5p上游引物為5′-TTTGGCACTAGCACATTTTTGCT-3′，miR-1271-5p 下游引物為 5′-CTTGGCACCTAGCAAGCACTCA-3′；U6 上游引物為 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，U6下游引物為 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。qRT-PCR采用ABI7500實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行分析，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法分析各個(gè)樣品的相對(duì)表達(dá)量。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲能力

轉(zhuǎn)染24 h后，細(xì)胞重懸浮于不含血清的培養(yǎng)基，分別加入Transwell和涂有Matrigel的Transwell上室中（100 μL，4×104/孔）。將含有20% FBS的600 μL培養(yǎng)基作為化學(xué)引誘劑加入底室中。細(xì)胞在37℃，5% CO2下孵育24 h。用4%多聚甲醛固定40 min，Giemsa染色30 min，PBS洗滌3次，光學(xué)顯微鏡拍照。采用Image J軟件計(jì)數(shù)遷移及侵襲細(xì)胞的數(shù)量。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，miR-1271-5p 表達(dá)水平在癌組織和相應(yīng)癌旁組織的差異比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；miR-1271-5p與患者臨床病理特征的關(guān)系分析采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；miR-1271-5p在不同胃細(xì)胞中的表達(dá)差異采用單因素方差分析，若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步的多重比較采用 Dunnett′s t檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法計(jì)算生存率，組間生存曲線(xiàn)的比較采用Log-rank檢驗(yàn)。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-1271-5p在胃癌組織中的表達(dá)

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，90例胃癌組織中miR-1271-5p的表達(dá)水平低于相應(yīng)癌旁正常組織（2.544±0.210 vs 4.427±0.340，t=-6.010，P＜0.001），見(jiàn)圖 1A；且miR-1271-5p高表達(dá)患者中位生存期較低表達(dá)患者延長(zhǎng)（42個(gè)月 vs 36個(gè)月，P=0.024），見(jiàn)圖1B。

圖1 miR-1271-5p在胃癌組織中的表達(dá)及與胃癌患者生存的關(guān)系Fig.1 Expression of miR-1271-5p in gastric cancer tissues and its relationship with survival in patients with gastric cancer

2.2 miR-1271-5p與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

在 90例患者中，T2～T3和N0～N1患者 miR-1271-5p表達(dá)量分別較相應(yīng)的T4患者和N2～N3患者升高（P＜0.05），Ⅰ～Ⅱ期患者 miR-1271-5p表達(dá)量高于Ⅲ～Ⅳ期患者（P=0.028），不同年齡、性別、分化程度、腫瘤大小和有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者miR-1271-5p表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 miR-1271-5p表達(dá)與胃癌病患者臨床病理特征的關(guān)系（±s，n=90）Tab.1 Correlation between the expression of miR-1271-5p and clinicopathological features in patients with gastric cancer（±s）

表1 miR-1271-5p表達(dá)與胃癌病患者臨床病理特征的關(guān)系（±s，n=90）Tab.1 Correlation between the expression of miR-1271-5p and clinicopathological features in patients with gastric cancer（±s）

Characteristic n miR-1271-5p expression level t P Age（year）＜60 39≥60 51 Gender Male 42 Female 48 Differentiation Low 66 Moderate or well 24 Tumor size（cm）≤4 41＞4 49 T status T2～T3 31 T4 59 N status N0-N1 43 N2-N3 47 Distant metastasis M0 85 M1 5 TNM stageⅠ-Ⅱ 25Ⅲ-Ⅳ 65 3.737 0.305 1.031±2.048 3.662±1.972 0.273 1.091 1.195±2.090 3.933±2.044 0.675 0.586 2.309±1.566 1.884±2.655 0.587 0.321 0.928±1.998 3.540±1.939 0.376 0.009 3.920±1.710 1.293±0.658 0.146 0.042 3.134±1.577 0.941±0.405 0.302 0.792 1.896±1.419 4.932±3.575 1.695 0.028 3.919±1.711 1.129±0.660

2.3 miR-1271-5p在不同胃細(xì)胞中的表達(dá)情況

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，人正常胃黏膜上皮細(xì)胞 GES1，胃癌細(xì)胞SGC7901、AGS和MGC-803中miR-1271-5p的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8714.536，P＜0.001）。人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES1比較，胃癌細(xì)胞SGC7901、AGS和MGC803的miR-1271-5p表達(dá)水平均降低（均P＜0.01），其中AGS細(xì)胞表達(dá)水平最低，因此選取該細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖2。

圖2 miR-1271-5p在不同胃癌細(xì)胞和人正常胃黏膜上皮細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 Expression of miR-1271-5p in different gastric cancer cell lines and normal gastric mucosal epithelial cell lines

2.4 miR-1271-5p在胃癌AGS細(xì)胞中的表達(dá)

轉(zhuǎn)染24 h后，采用qRT-PCR驗(yàn)證其轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-1271-5p組中miR-1271-5p相對(duì)表達(dá)量高于其陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（18.27±0.02 vs 1.001±0.002，t=846.200，P<0.001），見(jiàn)圖3。

圖3 miR-1271-5p在胃癌AGS細(xì)胞中的表達(dá)Fig.3 Expression of miR-1271-5p in gastric cancer AGS cells

2.5 過(guò)表達(dá)miR-1271-5p對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h、72 h及120 h后，過(guò)表達(dá)miR-1271-5p組細(xì)胞OD值均低于其陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.280±0.012 vs 0.358±0.003，t=6.270，P=0.011；0.641±0.021 vs 0.758±0.015，t=4.498，P=0.003；1.184±0.011 vs 1.624±0.022，t=17.910，P<0.001），見(jiàn)圖 4。

圖4 過(guò)表達(dá)miR-1271-5p對(duì)胃癌AGS細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of miR-1271-5p overexpression on proliferation of gastric cancer AGS cells

2.6 過(guò)表達(dá)miR-1271-5p對(duì)胃癌AGS細(xì)胞克隆形成能力的影響

平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-1271-5p組細(xì)胞克隆數(shù)量較陰性對(duì)照組少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（47±4）個(gè) vs（100±4）個(gè)，t=9.435，P<0.01）］，見(jiàn)圖5。

圖5 過(guò)表達(dá)miR-1271-5p對(duì)胃癌AGS細(xì)胞克隆形成的影響Fig.5 Effect of miR-1271-5p overexpression on colony formation of gastric cancer AGS cells

2.7 過(guò)表達(dá)miR-1271-5p對(duì)胃癌AGS細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-1271-5p組細(xì)胞遷移數(shù)量較其陰性對(duì)照組少［（279±8）個(gè)vs（385±11）個(gè)，t=7.677，P=0.002］，侵襲數(shù)量亦低于其陰性對(duì)照組［（176±8）個(gè) vs（302±8）個(gè)，t=11.220，P<0.001］，見(jiàn)圖 6。

圖6 過(guò)表達(dá)miR-1271-5p對(duì)胃癌AGS細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Fig.6 Effect of miR-1271-5p overexpression on migration and invasion ability of gastric cancer AGS cells

3 討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是胃癌最主要的生物學(xué)特征，也是導(dǎo)致治療失敗和患者死亡的主要原因，因此阻止胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移是改善預(yù)后的關(guān)鍵。而尋找參與胃癌形成和進(jìn)展的分子可能有助于其診斷和治療［8-9］。miRNAs在正常和病理情況下通常起基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡和侵襲等生物學(xué)行為，目前關(guān)于腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNAs表達(dá)譜研究也成為研究熱點(diǎn)之一［10］。miR-1271-5p是一種miR-96旁系同源物，在人類(lèi)非神經(jīng)元組織中以低拷貝數(shù)被發(fā)現(xiàn)，編碼于ARL10基因的第二個(gè)內(nèi)含子中［11-12］。研究證實(shí)miR-1271-5p在包括胃癌、腎細(xì)胞癌、子宮內(nèi)膜癌、肝細(xì)胞癌等細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，且通過(guò)調(diào)控相應(yīng)靶基因，發(fā)揮抑癌作用。在腎細(xì)胞癌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)miR-1271-5p過(guò)表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，且主要通過(guò)調(diào)控DOCK1基因?qū)崿F(xiàn)［13］；miR-1271也可通過(guò)靶向CDK1降低子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡［14］；還可通過(guò)調(diào)控miR-1271-5p/FOXK2/AKT軸抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移［15］。而在胃癌細(xì)胞MGC-803中miR-1271過(guò)表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖、遷移、侵襲并減弱細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力；在胃癌細(xì)胞SGC-7901中抑制miR-1271表達(dá)則作用相反，由此可見(jiàn)miR-1271在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用［16］。在胃癌組織中亦發(fā)現(xiàn)，在年齡較大，腫瘤較大，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，Ⅲ-Ⅳ期和分化程度低的患者中miR-1271的表達(dá)水平較低，且miR-1271高表達(dá)的患者總生存率高于低表達(dá)患者［17］。本研究采用qRTPCR方法檢測(cè)90例胃癌患者的癌組織及其相應(yīng)癌旁組織中miR-1271-5p的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-1271-5p在胃癌腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，且miR-1271-5p低表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期等不良臨床特征有關(guān)，miR-1271-5p高表達(dá)患者的生存期較低表達(dá)患者延長(zhǎng)，與上述研究結(jié)果一致，提示miR-1271-5p可能在胃癌的發(fā)生和進(jìn)展中起抑癌基因的作用。

為進(jìn)一步觀(guān)察miR-1271-5p對(duì)胃癌進(jìn)展的影響，本研究首先采用qRT-PCR檢測(cè)人胃癌細(xì)胞系（SGC-7901、MGC-803、AGS）和人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES1中miR-1271-5p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)相較于人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系GES1，miR-1271-5p在3個(gè)胃癌細(xì)胞系中均低表達(dá)，且AGS細(xì)胞表達(dá)量最低，因此選取該細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)。利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法成功建立過(guò)表達(dá)miR-1271-5p的胃癌AGS細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-1271-5p可抑制細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力，進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-1271-5p在胃癌發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮抑癌作用。

本研究表明，miR-1271-5p在胃癌組織及細(xì)胞系中低表達(dá)，miR-1271-5p過(guò)表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，在胃癌中發(fā)揮抗腫瘤作用。miR-1271-5p有望成為胃癌診斷和治療的新靶點(diǎn)，但具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。